التشخيص المخبري للبروسيلا

التشخيص المخبري للبروسيلا
استخدام اختبار التراص بالمستضد والمصل وحيد النوعية



البروسيلات لا تفرز ذيفانات خارجية وتعتمد امراضيتها على المعقد الشحمي السكري والبروتيني المتواجد في الجدار البكتري للبروسيلة الملساء، ويحتوي هذا المعقد على المستضدات M, A
البروسيلة المجهضة Br.abortus تكون كمية المستضد M<A بنسبة 1/20
البروسيلة المالطية Br.melitensis تكون كمية المستضد A<M بنسبة 1/20
البروسيلة الخنزيرية تكون كميتا المستضدين متساويتين تقريباً عند معظم الأنماط الحيوية
أما البروسيلة الغنمية والبروسيلة الكلبية فيحتوي المعقد الشحمي السكري البروتيني مستضدات سطحية خشنة تشبه مستضدات الذراري الخشنة للبروسيلة المجهضة والبروسيلة الخنزيرية.

**للتفريق بين أنواع البروسيلات ولتصنيف أنماطها المصلية يمكن تطبيق اختبار التراص على الشريحة ويستخدم مصل ضدي وحيد النوعية للمستضد (Monospecific antiserum M) ومصل ضدي وحيد النوعية للمستضد A. وأيضاً مصل ضدي وحيد النوعية للمستضدات R الخشنة. وعند استخدام المصل وحيد النوعية للمستضد M فقط والمصل وحيد النوعية للمستضد A، والمصل وحيد النوعية للمستضدات الخشنة في اختبار التراص على الشريحة.
نلاحظ حدوث التراص بالمصل وحيد النوعية A للبروسيلة المجهضة، والبروسيلة الخنزيرية ولا يحدث تراص للبروسيلة المالطية، لأن كمية المستضد A، في المالطية قليلة لا تسمح بحدوث التراص وعلى العكس نلاحظ حدوث التراص بالمصل وحيد النوعية M للبروسيلة المالطية، والبروسيلة الخنزيرية ولا يحدث تراص للبروسيلة المجهضة لأن كمية المستضد A في المالطية لا تسمح بحدوث التراص ويحدث المصل الضدي وحيد النوعية للمستضدات الخشنة R تراص البروسيلات الغنمية والبروسيلات الكلبية، وذراري البروسيلات الخشنة الأخرى.




التنميط باستخدام عاثيات البروسيلة (phage typing):

عاثيات الجراثيم هي فيروسات تتطفل على أنماط مصلية لأنواع معينة من الجراثيم تسبب انحلالها (Bacteriophages).
لذلك تستخدم عاثيات نوعية للبروسيلات (Brucella phages) للتفريق بين أنواع البروسيلات ولتحديد أنماطها المصلية، العاثيات الخاصة بالذراري الملساء للبروسيلة هي (tb) تيبليسي، (wb) وايبردج، (Fi) فايرنز، و(BK2) بيركيلي، أما العاثيات الخاصة بالذراري الخشنة فهي R/C – 9 – R/O.




اختبار الانحلال بتأثير عاثيات البروسيلة:

يمكن اختيار العاثيات التي ذكرت في التحديد الروتيني للاختبار: وهو أعلى تخفيف للعاثية يسبب تحللاً كاملاً لخلايا البروسيلة الثوي. كما تستخدم العاثيات في الجرعة RTD × 410 فالمستعمرات النامية على الآجار الانتقائي للبروسيلة تؤخذ منها مسحة وتمسح مرة أخرى من جديد على الآجار الانتقائي المصلي بالديكستروز، ويترك الطبق لعدة دقائق حتى يجف سطح المنبت.
بعد الجفاف تنقط قطرة من كل نوع من أنواع العاثيات في المكان المخصص على سطح الطبق المزروع بالبروسيلات في درجة حرارة الغرفة يترك لعدة دقائق ثم يحضن في درجة حرارة 37مْ، وبجو غاز Co2 (%10-5) لعدة أيام، يفحص بعدها الطبق وتلاحظ البقع التي يحدث فيها الانحلال بتأثير العاثيات خلال 48 ساعة، ثم يكرر فحص الطبق كل 24 ساعة، وتسجل النتائج.




الفحص المجهري للبروسيلات

الفحص المجهري المباشر:

يمكن تحضير شرائح من محتويات معدة الجنين النافق، خزع من العقد الليمفاوية، أو خزع من نقي العظام، فلقات المشيمة المطروحة، الإفرازات الرحمية – تثبت بالتسخين ثم تصبغ بزيل نلسن المعدلة (فوكسين – حمض الخل – ازرق الميتلين) بعد الغسيل والجفاف تفحص بالعدسة الزيتية الغاطسة.

الحالة الإيجابية:
تلاحظ جراثيم البروسيلات ملونة بلون زهري متجمعة داخل البالعات أو خارجها ويمكن الاعتماد على الأضداد التألقية لتشخيص البروسيلة باستخدام المجهر التألقي.
العينات:
الجنين النافق: تؤخذ عينات من محتويات معدة الجنين من العقد الليمفاوية، من نقي العظام.
الحيوان الحي: الإفرازات الرحمية أو المهبلية، فلقات المشيمة، الأغشية الجنينية الحليب أو اللبأ، الذي يحتوي في المليلتر الواحد في الحليب على عدة آلاف من جرثوم البروسيلة.
الذكور: من السائل الزليلي المفصلي – عينات من البربخ والخصية.



المرجع العلمي كتاب علم الأحياء الدقيقة الخاص
// د. إبراهيم الرفاعي & د. أنـور العمـر//

يتبع..............
__________________
الدكتور محمد علي جهاد عسكر
مدير العلاقات العامة والإعلان
[وحدهم المديرون لديهم صلاحيات معاينة هذا الرابط]

00963932655969

-------------------- إذا طعنت من الخلف فاعلم أنك تسير في المقدمة ---- ----------------
رد مع اقتباس الرد السريع على هذه المشاركة
Dr.askar
مشاهدة ملفه الشخصي
إرسال رسالة خاصة إلى Dr.askar
إرسال رسالة بريد إلكتروني إلى Dr.askar
البحث عن المشاركات التي كتبها Dr.askar
#2 تقرير بمشاركة سيئة
قديم 06-11-2007, 08:40 PM
الصورة الرمزية Dr.askar
Dr.askar Dr.askar متصل الآن
مدير العلاقات العامة والإعلان

تاريخ التسجيل: Apr 2006
الدولة: الطب البيطري
المشاركات: 1,322
إرسال رسالة عبر مراسل AIM إلى Dr.askar إرسال رسالة عبر مراسل MSN إلى Dr.askar إرسال رسالة عبر مراسل Yahoo إلى Dr.askar إرسال رسالة عبر Skype إلى Dr.askar
افتراضي
الزرع على المنابت الانتقائية :

العينات الداخلية: من نقي العظام والعقد الليمفاوية أو محتويات الجنين أو اللبأ تكون غير ملوثة بالجراثيم الأخرى أما عينات المشيمة أو الفلقات الجنينية تكون ملوثة بجراثيم أخرى غير البروسيلات لذلك يضاف إلى المنابت الانتقائية للبروسيلات صادات حيوية للجراثيم السلبية والإيجابية غرام وصادات فطرية وخمائرية بتراكيز مثبطة لنمو الجراثيم المصاحبة وغير مؤثرة على البروسيلة مع منشطات لنمو البروسيلة كالمصل ولهذا يستخدم آغار الدكسترور المصلي المعدل من قبل فاريل أو آغار آلبيمي الانتقائي (Al bimi) أو مستنبت Castanoda لزرع الدم.

 عينات الحليب يجب تثفيلها لمدة 10دقائق /3000 g ثم يزرع الراسب وطبقة الدهن.
 محتويات معدة الجنين تفرد عدة قطرات من هذه المحتويات على المستنبت الجامد الانتقائي.
 الأغشية الجنينية والفلقات المشيمية وقطع الطحال والرئة للجنين تغسل بالمحلول الملحي الفيزيولوجي المعقم، ثم تقطع إلى قطع أصغر في الحجم، ويمسح الوجه الداخلي المقطوع على سطح المنبت الانتقائي، أو نلجأ إلى تجانس العينة بأن نجرشها في مجرشة يدوية بالطحن أو آلية وتزرع على سطح المستنبت الجامد الانتقائي.
 تحضن المستنبتات المزروعة بجو من Co2 بنسبة %10-5 بدرجة 37مْ بين أسبوع وعشرة أيام.


حقن خنازير غينيا (القبيعات)


عينات الحليب تثفل لمدة 10 دقائق /g3000. ثم يحقن 2-1ملل من الراسب والدهن الطافي في العضل.
 الإفرازات المهبلية – فلقات المشيمة – الأغشية الجنينية، شديدة التلوث من الضروري تجانسها بالمحلول الملحي ومن ثم حقن 1-0.5 ملل من كل عينة في قبعتين في العضل وتقتل القبيعة الأولى بعد 3 أسابيع، والثانية بعد 6 أسابيع من الحقن.


ا
افتراضي الاختبارات المصلية
يمكن تطبيق عدة اختبارات مصلية لتشخيص داء Brucellosis، ويتوقف اختيار الاختبار المصلي حسب نوع الحيوان، طور المرض، ونوع الغلوبولين المناعي السائد في المصل.

الغلوبولينات المناعية في مصل الأبقار الطبيعية بالبروسيلة وبعد التلقيح
يظهر في مصول الأبقار بعد العدوى الطبيعية بالبروسيلة الغلوبولين المناعي الصنف IgM ثم الصنف (IgG2 , IgG1) IgG ويكون تركيز تحت الصنف IgG1 أعلى من تحت الصنف IgG2. وينخفض عيار IgM، ويصبح IgG1، وبدرجة أقل IgG2 هو الغلوبولين المناعي السائد في المصل خاصة في الحالة المزمنة.
وبعد تلقيح الأبقار بالذرية 19 يظهر IgM ويصل إلى أعلى مستوى له في المصل بعد 13 يوماً من التلقيح. ويحافظ على عياره المرتفع في الحيوانات الملقحة، بعكس ما يحدث في العدوى الطبيعية بالبروسيلة، وكذلك تظهر الأضداد IgG وتبلغ قيمتها العظمى خلال 42-28 يوماً بعد التلقيح ثم تأخذ الأضداد IgG بالتناقص تدريجياً، وتصبح مستويات غير قابلة لكشف عنها (في مصول العجول الملقحة بعمر 8-3 أشهر) بعد 6-3 أشهر، ويكون الصنف IgM هو الصنف المتبقي إذ وجد في الحيوانات الملقحة.
ومما تقدم نستنتج أنه من ضروري اختيار الاختبار المصلي المناسب والذي يحدد مستوى الأضداد السائد في مصل الدم، للتفريق بين العدوى التلقائية الطبيعية للبروسيلة وبين مستوى الأضداد السائد في مصل الدم الناتج عن التلقيح.


اختبار الحلقة في الحليب. Milk Ring Test
يعتبر اختبار الحلقة في الحليب الأكثر استخداماً في أكثر الدول التي تعاني من Brucellosis وهو من أسهل الاختبارات لكشف هذا الداء فأثناء العدوى الطبيعية بالبروسيلة يزداد مستوى الأضداد من نوع IgM يليه بكمية أقل IgA ثم IgG في الحليب ويفضل إعادة هذا الاختبار في السنة الواحدة من 4-3 مرات للقطيع الواحد.
وعندما تكون العينات إيجابية يجب اختبار أفراد القطيع، ويجب تطبيق اختبارات مصلية أخرى تؤكد وجود الداء أم لا.
كيفية الاختبار:
يوضع في أنبوب معقم 6 ملل حليب، ثم يضاف إليه قطرة من مستضد البروسيلة المجهضة Br.abortus الملونة بالهيماتوكسيلين (أزرق)، أو بالتيترازوليوم (أحمر)، يتم مزجهما جيداً ويحضن الأنبوب بدرجة 37مْ لمدة ساعة، وتقرأ النتيجة.
النتيجة الإيجابية: عندما توجد الأضداد النوعية من نوع IgM يحدث تراص المستضد ويطفو مع جزئيات الدهن، وتتشكل حلقة ملونة بلون أزرق وأحمر حسب لون المستضد المستخدم، ويبقى عمود الحليب أبيض اللون.
النتيجة سلبية: يتلون عمود الحليب بلون المستضد المستخدم، وتبقى الحلقة الدهنية بيضاء اللون.
النتيجة المشتبهة: تظهر حالات متوسطة للنتائج السابقة.


اختبار روز بنغال Rose Bengal Test

أيضاً اختبار روزبنغال من الاختبارات السهلة الأولية المستخدمة لكشف عن داء البروسيلة الطبيعية، وهو من الاختبارات عالية الحساسية ونسبة نتائج الاختبارات السلبية الكاذبة التي قد تحدث أثناء تطبيق هذا الاختبار ضئيلة. إلا أنه يعطي نتائج إيجابية كاذبة أكثر (نوعية الاختبار ليست عالية)، لذلك المصول السلبية في اختبار روزبنغال لا يجري عليها أي اختبار مصلي آخر، في حين المصول الإيجابية تجري عليها كل الاختبارات المصلية التي تؤكد وجود البروسيلة أو لا، مثل اختبار التراص في الأنابيب أو اختبار تثبيت المتممة.
كيفية الاختبار: توضع على شريحةمعقمة قطرة من مصل البقرة المختبرة ثم قطرة من مستضد روزبنغال بعضها إلى جانب بعض، يتم المزج بينهما «المستضد والمصل» وتحرك الصفيحة مدة 4 دقائق ثم تقرأ النتيجة.
الحالة إيجابية: حدوث تراص ولو بسيط.
الحالة سلبية: عدم حدوث تراص
ويكشف هذا الاختبار مستوى الأضداد IgG1 و IgG في مصل الأبقار المختبرة، وتزيد حموضة المستضد العالية من فعالة IgG1 في إحداث التراص.

اختبار التراص المصلي في الأنابيب Serum Agglutination test (SAT)

من ميزات اختبارات التراص المصلية المناعية في الأنابيب أنها تنفي أو تثبت وجود الإصابة بالعامل الممرض، وتعتمد هذه الاختبارات على نسبة وجود IgM أو تحت الصنف IgG في مصل الدم، وبينت الاختبارات المصلية المناعية أثناء الإصابة بالعدوى الطبيعية للبروسيلة أن نسبة IgG هو الغلوبولين السائد في المصل أما نسبة الغلوبولين IgG2 فهي قليلة، وبينت أن IgG1 ضعيف الفعالية في إحداث التراص أما زيادته فهي تؤدي إلى تثبيط التراص للغلوبولين المناعي IgM، مما يؤدي إلى حدوث نتائج سلبية كاذبة في اختبار التراص الأنبوبي، وتزداد هذه النتائج الكاذبة عند الإصابة في الطور المزمن للبروسيلة. كما يمكن أن تحدث نتائج إيجابية كاذبة في اختبار التراص الأنبوبي في مصل الأبقار الملقحة لوجود IgM في مصل هذه الأبقار، لذا من الأفضل إجراء اختبار التراص الأنبوبي على الأبقار غير الملقحة، أو التي لقحت في مرحلة مبكرة من عمرها بالعترة 19 للبروسيلة.
مبدأ الاختبار:
يستخدم في اختبار التراص الأنبوبي مستضد البروسيلة المجهضة المعياري (مثل المستضد المحضر في وايبرج بانجلترة المعاير بالمصل الضدي المعياري الدولي للبروسيلة المجهضة بحيث يحدث التراص بدرجة 50% (+2) في وجود 1.54 وحدة دولية من الأضداد في الميليلتر الواحد في المصل).
 تمدد عينة المصل المختبر في أنابيب بالمحلول الملحي الفينولي بحيث يحوي كل أنبوب على 0.5 مل من التخفيفات من 10/1 حتى 320/1.
 يضاف 0.5 ملل من المستضد المعياري في كل أنبوب ويمزج، فتصبح التخفيفات النهائية للمصل المختبر من 10/1 إلى 640/1.
 تحضن الأنابيب مدة 20 ساعة بدرجة 37مْ، ثم تفحص الأنابيب وتقدر نسبة التراص بدرجات 4+, 3+, 2+, 1+.
 يحدد عيار التراص النهائي: وهو أعلى تخفيف للمصل فيه تراص بدرجة (+1) أو أكثر، ويحول عيار التراص النهائي إلى وحدات دولية/ملل باستخدام جدول خاص.
وتعد نتيجة الاختبار إيجابية في الأبقار إذا كان عيار التراص النهائي 100 وحدة دولية/ملل أو أكبر وفي الأغنام والماعز 50 وحدة دولية/ملل أو أكبر. ويفضل إجراء اختبار المتممة لتأكيد نتائج اختبار التراص الأنبوبي إلا إذا كان عيار التراص الإيجابي أكثر من 900 وحدة دولية/ملل. عندها يكتفى بنتيجة اختبار التراص.

اختبار تثبيت المتممة Complement Fixation test CFT

يعتبر اختبار تثبيت المتممة من أفضل الاختبارات المصلية التي تستخدم لتشخيص داء البروسيلا عند الأبقار، لأن هذا الاختبار يكشف عن الأضداد المثبتة للمتممة من نوع IgG1 أولاً وIgM ثانياً، وهذا يساعد في كشف داء البروسيلا المزمن عند الأبقار والسبب أن الأضداد المثبتة للمتممة تبقى في المصل مدة أطول من الراصات. ويلعب اختبار تثبيت المتممة دوراً في التفريق بين تفاعلات الأضداد الناتجة عن التلقيح وعن الإصابة الطبيعية بداء البروسيلا عند الأبقار. لأن اختبار تثبيت المتممة يعطي نتائج سلبية في العجول الملقحة بالذرية 19 بعد ستة أشهر من التلقيح بينما يمكن أن تكون نتيجة اختبار التراص الأنبوبي إيجابية في العجول الملقحة.

اختبار كومبس أو اختبار ضد الغلوبولين Coombs antiglobulin

يستخدم اختبار كومبس لتشخيص عدوى البروسيلة المزمنة عند الإنسان ويكشف الاختبار الغلوبولين المناعي IgM, IgG والأضداد وغير الكاملة، ويستخدم اختبار كومبس المعدل من قبل Mgjdu لتشخيص البروسيلة المالطية في الأغنام.

المقايسة المناعية بالإنظيم المرتبط ELISA
يُمكنِّ اختبار الاليزا من كشف أضداد البروسيلة في مصل دم الحيوانات المصابة بهذا الداء ويمكننا من تحديد ومعايرة تحت صنف الغلوبولين المناعي النوعي للبروسيلة في المصل (IgG1). ولهذا الاختبار يمكن استخدام مستضدات كاملة (خلايا جرثومية) أو مركباتها مثل المستضدات المكونة من عديد السكريد المستخلص من جرثوم البروسيلة.

اختبار إرجاع الرابطة ثنائية الكبريت Disuphid Bond Reduction Test .

يستخدم الاختبار لكشف عن IgG في مصل الحيوان المصاب بالبروسيلة بعد التخلص من التفاعلات غير النوعية والتفاعلات الإيجابية الكاذبة التي قد تحدث في المصل بسبب وجود IgM خاصة في الأبقار الملقحة بالذرية 19.
يعالج المصل بالمركبات التي ترجع الروابط ثنائية الكبريت في جزيء IgM مما يؤدي إلى تحطيم جزىء IgM. ويجري اختبار التراص على المصل قبل المعالجة، وكذلك بعد المعالجة بأحد المواد التي تحطم شكل الجزىء IgM وتفقده الخواص الضدية مثل مادة Mercaptoethanol أو مادة Dethiothreitol. ثم يقارن عيار التراص النهائي للاختبار قبل المعالجة مع العيار بعد المعالجة، ويدل انخفاض عيار التراص بشكل ملحوظ بعد إضافة المادة المذكورة على وجود IgM لوحدة في المصل المختبر.
مثلاً عند انخفاض العيار من 80/1 مثل المعالجة إلى 10/1 بعد المعالجة. ولا يشير ذلك إلى وجود عدوى بالبروسيلة. أما إذا لم يتغير عيار التراص أو إذا ازداد بعد المعالجة فذلك يدل على وجود IgG وبالتالي يدل على وجود إصابة بالبروسيلة.

الاختبار الجلدي الأدمي Allergic test.
يستخدم الاختبار الجلدي الأدمي عند الإنسان والأغنام والماعز وبدرجة أقل عند الأبقار ويفيد في تشخيص داء البروسيلة المزمن، ويمكن استخدام هذا الاختبار من اليوم الثلاثين من بدء الإصابة، والبروسيلين المستخدم يولد أضداداً مع نوع الراصات ويظهر في مكان الحقن احمرار جلدي وانتفاخ يدل على الإصابة بالبروسيلة ويستخدم لهذا الاختبار بروسيلين نقي من البروسيلة المالطية في الطور الخشن مثل Brucelin INRA أو بروسيلين محضر من البروسيلة الملساء مثل بروسيلين F ويتم تحضيره بواسطة حلمهة حامضية للجزئيات البروتينية في البروسيلة الملساء.منقول