- العوامل المؤثرة على محصول الجنين :
نسبة إنتاج الجنين :
تتغير نسبة إنتاج الجنين إلى حد كبير في الجمال وتعتمد على العديد من العوامل مثل معالجة الإباضة المتعددة والخصوبة والإدارة وموعد الجمع والخبرة . وتتراوح نسبة إنتاج الجنين في الناقة من 114% إلى 384% وتتأثر بعدة عوامل .
أ- إناث معطية بدون إباضة متعددة :
يمكن القيام بجمع الأجنة في الحيوانات التي لا تعتبر ذات إباضة متعددة إذا كان عدد النوق المستقبلة محدوداً. وفي جمل السنام الواحد تم الحصول على نسبه بلغت 85% في وحيدة الإباضة و165% في مزدوجة الإباضة مما يعني أن التخصيب يمكن أن يكون عالياً جداً إذا تمت إدارة التكاثر بشكل جيد . وكانت نسبة الإنتاج أعلى في النوق مزدوجة الإباضة وضعيفة في وحيدة الإباضة . مما يعني أن الإباضة المضاعفة لا تؤثر على نسبة الخصوبة وبقاء الجنين حتى اليوم السابع بعد الإباضة . وفي جمال أميركا الجنوبية بلغت نسبة الإباضة المزدوجة حوالي 10% ، وترتفع نسبة الإباضة المزدوجة إلى 20% في الحيوانات التي حفزت باستخدام hCG أو GnRH .
ب- إناث معطية بإباضة متعددة :
تعتبر نسبة إنتاج الجنين في النوق المانحة بإباضة متعددة متغيرة إلى حد كبير (114 إلى 384%) ، وقد يرجع السبب في هذا التغير العالي إلى العديد من العوامل بما في ذلك فشل الإباضة أو اللوتنة الشاذة أو نسبة تخصيب ضعيفة أو عدم انتظام تطور الجنين ونقله . ويمكن أن يحدث فشل الإباضة إذا لقحت الحيوانات في وقت مبكر جداً ( قبل أن تصل الجريبات حجم البلوغ ) أو إذا كان هناك استجابة منخفضة لـ LH بعد التلقيح . ولتخفيف هذه المشاكل يجب ألا تلقح النوق المانحة قبل أن يصبح قطر الجريبات 10 ملم على الأقل وليس أكثر من 18 ملم ، ويجب أن تعطى الحيوانات متعددة الإباضة أيضاً حقن hCG (IU 3000) عند التكاثر أو خلال 24 ساعة منه .
ويمكن لنوع معالجة الإباضة المتعددة أن يكون له تأثير كبير على نسبة إنتاج الجنين ، ففي دراسة ذات أثر رجعي على العديد من نتائج الإباضة المتعددة أنتجت النوق المعالجة بـ FSH أجنة أكثر (417% تلقيح طبيعي و188% للاصطناعي ) من النوق المعالجة بـ eCG وتأثيره الطويل الأمد الشكل (11).
.
الشكل (11) a-f مراحل تطور ودرجات جنين الناقة
الجدول (4) تصنيف الأجنة .
الصفات
الدرجة
نوعية جنين ممتازة ، الحجم متناسب مع مرحلة الجمع بالنسبة للإباضة . قبل اليوم الثامن يجب أن يكون كروياً بشكل كامل مع سطح ناعم .
الدرجة I
جنين جيد مثل السابق مع بعض الشذوذ في الكفاف وخلايا ناتئة قليلة جداً
الدرجة II
نوعية متوسطة ، جنين صغير مع بقع غامقة اللون وكفاف شاذ وبعض الخلايا الناتئة
الدرجة III
أجنة هابطة تظهر منطقة مظلمة من التحلل وخلايا خارجة كثيرة .
الدرجة IV
غير قابل للنقل ، أجنة هابطة ومظلمة أو أجنة معاقة ، وكل المراحل التي جمعت من الرحم كانت أصغر من الكفاف وإباضة غير مخصبة .
الدرجة V
تأثير توقيت الشطف على نسبة إنتاج الجنين :
من المعروف جيداً في الوقت الراهن في الجمال أن الجنين لا يصل إلى الرحم حتى اليوم السادس أو السادس والنصف بعد الإباضة ستؤدي إلى نسبة إنتاج منخفضة. وعلى أية حال يتم الحصول على أفضل نسب لإنتاج الجنين عندما يتم كشط النوق المانحة في اليوم السابع أو بعد ذلك . وفي دراستين منفصلتين بلغت نسب الإنتاج 114% و179% و267% بعد الكشط في اليوم السادس واليوم السادس والنصف واليوم السابع بعد الزواج ، كما بلغت 60% و157% و175% و200% و300% للجمع في اليوم السادس واليوم السادس والنصف واليوم السابع واليوم السابع والنصف واليوم التاسع على التوالي . وكان تأثير تاريخ الجمع على نسب إنتاج الجنين أكثر وضوحاً في النوق متعددة الإباضة بسبب التأخير المحتمل في الانتقال بقناة الرحم والتخصيب ، وهذه الملاحظة المانحة بعد جمع الجنين . وفي الحقيقة فإن العديد من النوق المانحة تصبح حامل بعد الكشط مرتين لمدة 12 إلى 24 ساعة .
الكشط الخطأ :
يمكن أن تؤدي عدم توفر الخبرة اللازمة للفني إلى العديد من حالات الكشط الفاشلة ، ويكون لدى معظم المهنيين من عديمي الخبرة صعوبات في تقدير موقع وسط الكفة ويمكن أن يذهب بعيداً جداً في القرن الرحمي ، ولذلك يؤدي وضع الكفة بشكل سيء إلى الانقلاب وفقدان السائل في التجويف المهبلي ، كما أن إدخال القسطرة في القرن الأيسر قد يكون صعباً للفني الأعسر والعكس بالعكس . ويمكن أن تؤدي المعالجة القاسية أيضاً إلى النزيف مما يجعل التعرف على الجنين صعباً جداً
فشل الإباضة :
ينتج فشل الإباضة عن نقص أو عدم إطلاق LH ، وقد لوحظ في النوق فشل الإباضة في 15 إلى 20% من النوق المانحة حتى وإن تم التقيد بمعايير قرار التلقيح . ويعتبر فشل الإباضة أكثر شيوعاً في الحيوانات ذات الإباضة المتعددة ويظهر في النمو الكبير للجريبات غير الإباضية . ويعني حدوث فشل الجريبات في الإباضة حتى وإن حقنت النوق مع hCG أو GnRH أن بعض الجريبات ينقصها الاستقبال الملائم لهذه الهرمونات . وفي بعض الحالات ترتد الجريبات بعد التكاثر بدلاً من الإباضة ، وقد يكون السبب في ذلك نسبة غير صحيحة بين LH و FSH خلال معالجة الإباضة المتعددة .
ويمكن أن تحدث استجابة ضعيفة للإباضة أيضاً عندما يستند قرار التكاثر على تلقي الأنثى ، وذلك بسبب حقيقة أن النوق متعددة الإباضة يمكن أن تصبح متلقية حتى في وجود جريبات صغيرة غير ناضجة تفشل في الإباضة . ويحتمل أن يكون ذلك هو السبب في أن البدء مبكراً في جمع الجنين في الناقة حقق نسبة منخفضة جداً في إنتاج الجنين وفي النوق التي عوملت بـ eCG يمكن أن ينتج فشل الإباضة عن لوتنة مبكرة للجريبات .
نقص الخصوبة :
يعتبر فشل التخصيب مشكلة عامة في الحيوانات ذات الإدارة السيئة ، وقد سجل التخصيب القليل أو غير الكامل في بعض الذكور ذات مني ذي نوعية منخفضة . وفي إحدى الدراسات فشلت كل النوق التي لقحت إلى ذكر كان عنده تركيز مني منخفض ( أقل من 20 مليون /مل ) في أن تنتج جنيناً . وهناك عوامل أخرى أيضاً يمكن أن تدخل أسباب في التخصيب الضعيف ونسب إنتاج الجنين ، فقد لاحظنا حالة نقص كامل للتخصيب على الرغم من التركيز الطبيعي لمني الذكر وحركته .
وتؤثر بضع مشاكل مرضية مثل التهاب البوق الرحمي والتهاب بطانة الرحم على التخصيب وبقاء الجنين وانخفاض إنتاج الأجنة في النوق المانحة . ففي حالة التهاب بطانة الرحم يكون سائل الكشط عادة سميكاً أو غامقاً ويحتوي على بقايا الجنين يتأثر أيضاً بعمر الأنثى المانحة ، فقد وجد في دراسة على جمل السنام الواحد أن إنتاج الجنين كان أعلى في النوق المانحة بعمر 12 سنة أو أكثر من النوق الأصغر (285% مقابل 149%) . وقد أنتجت النوق عديدة الولادة أجنة أكثر من النوق التي لم تحمل من قبل (353% مقابل 121%) . وقد يكون تأثير العمر ناتجاً أيضاً عن وجود متزايد لحث المبيض في النوق الأصغر .
وقد يعاق تخصيب البيض ونقل الجنين أيضاً بسبب وجود جريبات إباضية كبيرة ، فقد وجد أن نسبة إنتاج الجنين كانت أعلى في النوق بدون جريبات غير إباضية (220%) من النوق التي لديها تلك الجريبات (148%) ، وهذا يعني أن المعالجة بالبروجسترون قادرة على تنظيم موجة الجريب وزيادة الاستجابة للجريبات .
ولوحظت أيضاً نسب أقل لإنتاج الجنين بسبب تخصيب ضعيف عندما يتم تلقيح النوق المانحة بشكل اصطناعي ، وتكون نسب الإنتاج في النوق المانحة ذات التلقيح الطبيعي أعلى بشكل متوافق (299%) من النوق الملقحة صناعياً بالمني الطازج (199%) أو المني (124%) ، ولم تجر أي دراسة على نسب إنتاج الجنين بعد التلقيح الصناعي بالمني المجمد . وقد يكون التأثير السلبي للتلقيح الصناعي على نسبة إنتاج الجنين ناتجاً عن حث غير كاف للإباضة أو نسبة تخصيب ضعيفة .
أجهزة سيئة :
يجب التأكد من سلامة كل الأجهزة المستخدمة في الكشط قبل الاستعمال , وكانت أغلب الأجنة التي جمعت من الرحم في النوق في مرحلة الكيسة الأرومية وهذا يجعلها عادة أكثر عرضة للالتصاق بالسطوح القاسية وبالحطام الخلوي ومن السهل أن تفقد خلال المعالجة.
3- تقييم الأجنة :
تكون الأجنة المسترجعة من الرحم في النوق عموماً في مرحلة الكيسة الأرومية ، ويتغير حجم الجنين إلى حد كبير في المراحل المختلفة بعد الإباضة .
ويدخل الجنين في ناقة السنام الواحد إلى الرحم بعد 6 إلى 6.5 يوم من الإباضة في مرحلة الكيسة الأرومية المبكرة مع منطقتها الشافة . وعلى أية حال يبدو أن مدة هذه المراحل تكون قصيرة جداً وأغلبية الأجنة التي جمعت في اليوم 6.5 أو 7 لقحت مسبقاً في اليوم السابع. وفي إحدى الدراسات فإن 75% من الأجنة التي جمعت في اليوم السابع بعد التلقيح كانت في مرحلة الأرومية . و كانت الأجنة التي استرجعت من ناقة السنام الواحد بعد سبعة أيام من الزواج متغيرة جداً في الحجم ويتراوح قطرها بين 500 إلى 175 نانومتر ، وقد يرجع هذا التغير في مرحلة التطور إلى الانتشار الكبير للإباضة في الحيوانات متعددة الإباضة . وتستمر الأجنة المفقسة في النمو بشكل سريع وتصبح مرئية بشكل سهل بالعين المجردة مع توسعها ، ثم تبدأ في فقدان شكلها الكروي في اليوم 8.5 أو 9 بعد الإباضة وتصبح مطوية .
ويصنف نظام التقييم المستعمل من قبل أكثر الباحثين الجنين في خمس درجات طبقاً لخصائصها النسيجية ومراحل تطورها ( الجدول 4) . ويجب أن يبحث المتخصص عن الشذوذ مثل القطعة الأرومية المقذوفة وإشارات الانحطاط ( مناطق مظلمة ) وأشياء نسيجية شاذة واضحة مثل الطوي أو التجعد .
(ج) إدارة النوق المستقبلة :
تعتبر نوعية النوق المستقبلة هي العامل الأكثر أهمية في نجاح أي برنامج لنقل الأجنة ، أما العاملان الرئيسيان لاختيار النوق المستقبلة لنقل الجنين فهما فحص مشاكل الإنتاج والصحة والتحضير أو التزامن مع النوق المانحة .
1-معايير اختيار النوق المستقبلة :
يتم الحكم على النجاح الإجمالي لبرنامج نقل الأجنة بناء على نسبة الولادة ونسبة بقاء ونمو النسل . وبالتالي فإن معايير اختيار النوق المستقبلة في برنامج نقل الأجنة يجب أن تتضمن خصوبة جيدة وحمل طبيعي وإرضاع طبيعي . وفي برنامجنا لنقل الأجنة تضاعفت نسبة النجاح عندما تم تطبيق برنامج صارم لاختيار النوق المستقبلة . ويمكن تلخيص هذا البرنامج كالتالي :
التاريخ : يجب أن تكون النوق المستقبلة صغيرة ( العمر أقل من 12 سنة ) ، وكان لها على الأقل حمل طبيعي واحد بولادة طبيعية ، وتكون أما حبلى حالياً أو مفطومة مؤخراً .
الجدول (5) نتائج نقل الأجنة ، جمعت من إناث غير فائقات الإباضة من 7 إلى 7.5 يوم بعد التزاوج .
85%
نسبة الإباضة
95%
نسبة الاسترجاع
1.16
معدل الجنين لكل أنثى
42%
نسبة الحمل بعد النقل
4.1
المدة بين الجمع والتزاوج (أيام)
21
المدة بين الجمعين (أيام)
8
عدد مرات الجمع في الموسم
يجب أن يركز الفحص العام للمستقبلة على الموافقة وشرط الجسم الجيد وعلى أعراض الضعف أو الأمراض المعدية . ويجب كذلك فحص كل النوق المستقبلة المحتملة ضد داء البروسيلات أو الحمى المالطية وداء المثقبيات .
ويجب فحص قابلية التكاثر على النوق المستقبلة المحتملة بما في ذلك الجس والتصوير فوق الصوتي للمنطقة التناسلية وطبيعة الرحم والفحص المهبلي وفحص الضرع .
وبالإضافة إلى الفحص المنتظم للمنطقة التناسلية يجب فحص عينة رحمية طبيعية من أي أنثى لا يوجد لها سجل كامل .
2- التزامن مع النوق المانحة :
من المعروف بشكل جيد في الوقت الراهن أن فرص بقاء الجنين تعتمد بشكل كبير على طبيعة الغدد الصماء لدى النوق المستقبلة ، ومن أجل هذا الأمر يعتبر التزامن
الجدول (6) نتائج برنامج نقل الأجنة.
Inhibin
eCG
FSH
80
70
70
الاستجابة للإباضة المتعددة
80
80
80
% الإباضة
2إلى 25
2إلى 25
2إلى 25
معدل الإباضة (تقدير الهيئات الصفراءة بالتصوير فوق الصوتي)
1 إلى 8
0 إلى 19
0إلى 21
عدد الأجنة التي جمعت مراحل الأجنة عند الجمع
100
90
90
%أرومة مخصبة
-
6
8
%أرومة مبكرة
-
4
2
%غير مخصبة
49
38
42
نسبة الحمل بعد النقل
بين الدورة المنتجة للمتبرع والنوق المستقبلة هاماً جداً . وتوضح نتائج نقل الجنين في جمل السنام الواحد أن النوق المستقبلة الأفضل يجب أن تلقح في نفس يوم المانحة أو بعدها بحدود ساعة .
ويمكن معرفة تزامن البيئة الرحمية بين النوق المانحة والمستقبلة من خلال تزامن الإباضة أو بالتحضير الكامل بالعلاج الهرموني .
أ- تزامن تطور الجريب والإباضة :
يمكن أن يتم تزامن الإباضة بين النوق المانحة والنوق المستقبلة باستعمال طريقتين : إما اختيار النوق المستقبلة من مجموعة عشوائية ، أو تحضير النوق المستقبلة بأسلوب يتزامن فيه تطور الجريب مع النوق المانحة .
وفي الأسلوب الأول يتم فحص مجموعة إناث مستقبلة ذات دورة بعد 24 ساعة من تلقيح النوق المانحة ويتم معالجة كل النوق التي عندها جريب بالغ ونغمة رحمية مع GnRH أو hCG . وتعتبر هذه الطريقة في اختيار النوق المستقبلة على أية حال مستهلكة للوقت ويمكن أن تستخدم فقط إذا كان عدد النوق المانحة حدوداً أو إذا كانت النوق المانحة غير متعددة الإباضة .
وتمت محاولة التزامن في التطور الجريبي بين النوق المانحة والنوق المستقبلة باستعمال Progestagen بدرجات متفاوتة من النجاح ، كما تمت محاولة تزامن النوق المستقبلة باستخدام أدوات إطلاق البروجسترون داخل المهبل ( PRID سبعة أيام ) في جمل السنام الواحد لكنها لم تكن ناجحة . وقد استجابت 39% و28% من النوق فقط للإباضة بعد استلام 3000 hCG IU و20غ Buserelin بعد إزالة أدوات PRID . وقد كان لدى نسبة كبيرة من النوق مستويات عالية من البروجسترون قبل المعالجة مع hCG أو نظير GnRH واعتبرت كأن لها إباضة آنية كاستجابة للبروجسترون . ولا يرجع السبب في البروجسترون المرتفع في الحيوانات غير المعاملة إلى الإباضة التلقائية كما اقترح من الباحثين وإنما إلى وجود جريبات لوتنية إباضية والتي تتطور في 30 إلى 40% من إناث جمل السنام الواحد غير الفاقسة .
ويتم الحصول على أفضل النتائج لتزامن الإباضة عندما يتم حث النوق المستقبلة للإباضة باستخدام hCG (3000 أو 5000 IU ) أو Buserlin (20 نانو جرام ) بعد المعالجة بجمع البروجسترون وeCG IU . ويتم جدولة المعالجة بالبروجسترون لكي تنتهي في يوم حقن النوق المانحة بالمنشط المنسلي gonadotropin ، وتضمن المعالجة بـ eCG وجود جريبات بالغة عند النوق المانحة بحوالي 24 إلى 48 ساعة . وعلى أية جال فإن جرعة eCG والاستجابة للإباضة عند النوق المستقبلة بواحد أو اثنين أو أكثر من ست أجسام صفراء وبالتالي فإن الاستجابة العالية من النوق المستقبلة إلى eCG غير مرغوبة لأنها قد تسبب ارتداداً مبكراً لأجسام الصفراءة .
ب- تحضير النوق المستقبلة بالبروجسترون :
يمكن الحصول على التزامن بين الجنين والرحم بعلاج البروجسترون بدون حث الإباضة حيث يعطى البروجسترون (100 مغ) يومياً اعتباراً من يومين بعد تلقيح النوق المانحة . وعلى أية حال وبسبب عدم وجود جسم أصفر فإن المعالجة بالبروجسترون يجب أن تستمر خلال الحمل .
ويمكن استخدام النوق المستأصلة المبيضين كمستلمة أيضاً ، حيث يتم معالجة النوق لمدة يومين مع استراديول Estradiol 17 (40 مغ/يوم) ثم الحقن اليومية من البروجسترون (100 مغ) . وقد أثمرت هذه المعالجة عن نسبة حمل قدرها 30% لكنها تركت بسبب الحاجة للمعالجة اليومية بالبروجسترون خلال الحمل .
(د) فحص النوق المستقبلة :
يجب فحص كل النوق المستقبلة في اليوم الذي يتم فيه النقل للتحقق من حدوث الإباضة ومن وجود جسم أصفر بالغ ، ويمكن القيام بهذا الفحص إما بتحديد مستوى بلازما البروجسترون أو بواسطة رؤية الأجسام الصفراء بالتصوير فوق الصوتي .
ويعتبر مستوى بلازما البروجسترون الذي يساوي 2 نانوجرام/مل أو يكون أعلى منها مؤشراً جيداً لوجود جسم أصفر ناضج ، وقد استعملت هذه التقنية بنجاح لفحص النوق المستقبلة بعد سبعة أيام من حث الإباضة . وعلى أية حال يمكن أن تعطي هذه التقنية نتائج ضعيفة إذا تم فحص النوق المستقبلة في اليوم الخامس والسادس بعد الإباضة لأن مستويات البروجسترون ليسة عالية بشكل كاف في بعض النوق في هذه المرحلة حتى وإن حدثت الإباضة .
ويبقى الكشف بالتصوير فوق الصوتي عن الجسم الأصفر هو التقنية الأكثر دقة وسرعة لكشف تلك الأجسام إذا تم القيام به من قبل شخص خبير وبالإضافة إلى ذلك فإن هذه التقنية تسمح بفحص النوق المستقبلة للكشف عن المشاكل المرضية مثل وجود سائل في التجويف الرحمي .
وفي النوق المستقبلة التي تم إعدادها بالإستروجين والبروجسترون يستند الاختيار على النسيج الصدوي Echotexture ونغمة الرحم ، فالنوق المستقبلة المثالية يجب أن يكون لديها تجانس رحمي مع غياب السائل أو الخزب ويكون الرحم مرتخياً .
1-نقل الأجنة :
يمكن القيام بنقل الجنين إلى النوق المستقبلة باستخدام التقنية الجراحية أو غير الجراحية .
أ- النقل الجراحي للجنين :
يتم القيام بالنقل الجراحي للجنين في جمل السنام الواحد والجمال ذات السنامين عن طريق شق الجناح الأيسر للبطن ، حيث يتم نقل الجنين إلى التجويف الرحمي من خلال ثقب يجعل في القرن الذي يتم إخراجه باستخدام ماصة Pasteur . ومن المفيد في جمل السنام الواحد أن يجعل حز صغير في الغشاء المصلي ( Serosa) أولاً قبل شق الطبقة العضلية الرحمية وإيداع الجنين . وعلى أية حال فإن هذه التقنية لا يمكن أن تستعمل في الحيوانات الصغيرة أو البكر لأن القرن الرحمي يكون قصيراً ومن الصعب جداً أن يتم استخراجه .
ب- النقل غير الجراحي للجنين :
تشتمل التقنية غير الجراحية لنقل الجنين على وضع الجنين بشكل مباشر في تجويف الرحم من خلال العنق باستخدام بندقية تلقيح الأبقار العادية ، حيث يحمل الجنين في قصبة بلاستيكية معقمة (0.25 ما أو 0.5 مل) ويوضع في بندقية النقل . وتغطى بندقية التلقيح أولاً بغطاء معقم مع فتحه جانبية ثم في غطاء صحي بلاستيكي ثان .
ويتم إعداد النوق المستقبلة بنفس الأسلوب المذكور في جمع الجنين ، وقد اقترح بعض الباحثين استعمال تخدير موضعي . يتم إدخال بندقية التلقيح في المهبل وتوجيهها نحو العنق ، ثم يثقب الغطاء بعد اجتياز الحلقة العنقية الأولى ثم تدخل البندقية أكثر في أحد القرنين الرحميين ، ويجب أن يتم المرور العنقي والإيداع الرحمي للجنين بشكل سريع لتجنب الحساسية المفرطة للعنق والغشاء المخاطي للرحم والتي قد تسبب إطلاق Prostaglandi F2a وفناء الجسم الأصفر .
وكبديل لذلك يمكن توجيه إدخال ماصة النقل بشكل مهبلي باليد مع لبس قفاز معقم ، وهذه التقنية مفضلة من قبل المبتدئين لأن المعالجة العنقية في المستقيم صعبة .
2- الإدارة بعد النقل :
اقترح بعض الباحثين معالجة النوق المستقبلة بعقاقير غير استراديولية ومضادة للالتهاب (Meglumine 500, IV mg flunixin ) لمنع تحرير Prostaglandi من الرحم كنتيجة للمعالجة العنقية وبالإضافة لذلك تعطى النوق المستقبلة مضادات حيوية لتجنب التلوث الرحمي . وبالنسبة للإناث المستقبلة التي تم إعدادها بالبروجسترون فإن إعطاء البروجسترون (100 مغ/يوم IM ) يجب أن يستمر حتى نهاية الحمل . وقد أدت المحاولات لاستبدال المعالجة بالبروجسترون بزراعة صناعية Silastic إلى الإجهاض . ويمكن تشخيص الحمل في النوق المستقبلة مبكراً بمقدار ثمانية أيام بعد النقل ، على أية حال فمن أجل زيادة دقة التشخيص يجب أن يؤخر حتى مضي أسبوعين بعد النقل . ويعتبر التثبت من وجود جسم طبيعي أصفر للحمل مهماً جداً من أجل قرار التوقف أو الاستمرار في المعالجة بالبروجسترون ، وإن لم يكن هناك جسم أصفر فإن بقاء الحمل سيتطلب حقنة يومية من البروجسترون (100 مغ) حتى الولادة . ويجب فحص النوق المستقبلة التي حافظت على الحمل البروجسترون الخارجي بشكل دوري لمعرفة أي شذوذ في الحمل مثل تقيح الرحم وتعطنه . وقد وجد عدد لا بأس به من النوق المستقبلة التي بقيت حامل بالبروجسترون الخارجي تعاني من عسر الولادة بسبب الارتخاء غير الكافي للعنق .
(ه) نتائج الحمل بنقل الجنين في الجمال :
بناء على الدراسة فإن نسب الحمل التي تم الحصول عليها بنقل الجنين في جمل السنام الواحد تتغير من 8 إلى 50% ، وتتأثر نسب الحمل بشكل واضح بالفصل ونوعية النوق المستقبلة . على أية حال فإن العوامل الأخرى مثل جانب النقل وطريقة النقل وعمر الجنين ليس لها أي تأثير على نسبة الحمل .
1- تأثير نوعية الجنين :
يمكن أن تتأثر نسبة الحمل والولادة بعد نقل الجنين بعدة عوامل ، وما تزال البيانات المتوفرة عن نقل الجنين في الجمال محدودة جداً وبالتالي فإن تأثير العوامل المختلفة على نسبة النجاح لم يتم التحقق منه بشكل كامل ، وأغلب ما يعرف اليوم عن هذا الموضوع من نقل الجنين يتعلق بجمل السنام الواحد .
ومن الصعب معرفة العلاقة بين نوعية الجنين ونسبة الحمل بسبب الصعوبة في تقييم الجنين المخصب ، ففي دراسة صنف فيها الجنين من 1 إلى 5 كانت نسبة الحمل أعلى لدرجة الجنين 1 من درجة 2 أو أكثر . ويوحي التحليل بأثر رجعي على الخصائص التركيبية لكل جنين منقول ونتيجة الحمل أنه يمكن تصنيف الأجنة في ثلاثة أصناف رئيسية فقط هي : نوعية جنين جيدة قابلة للنقل ، ونوعية جنين متوسطة قابلة للنقل ، وجنين غير قابل للنقل . ويتضمن الصنف الأول كل الأجنة المخصبة بالتطور الطبيعي طبقاً لتاريخ الجمع ، ويمكن أن تكون هذه الأجنة مستديرة أو منهارة ولكن يجب أن يكون لديها تألق جيد ولا تظهر العديد من الخلايا المقذوفة . وتحتوي أجنة النوعية المتوسطة على بضعة أنواع من الأمور الشاذة بما في ذلك خسارة التألق ( لتصبح مظلمة ) والتعرف الخارجي الضعيف . ويتضمن الجنين غير القابل للنقل كل الأجنة التي لديها نقص أساسي من المادة الخلوية أو في مرحلة متقدمة جداً من التحلل كما هو واضح في تشكلها العام أو لونها .
2- تأثير نوعية الأنثى المستقبلة :
تعتبر خصوبة النوق المستقبلة العامل الأكثر أهمية في نجاح نقل الجنين في أي فصيلة ، وقد لوحظ تقدم كبير في الحمل ونسبة الولادة بعد تبني برنامج صارم لاختيار النوق المستقبلة مستند على الزرع الرحمي وفحص العينة . وبشكل مشابه ذكر باحثون آخرون أن خصوبة الأنثى المستلمة وعمرها والتكافؤ لها تأثير هام على نسبة الحمل بعد نقل الجنين في جمل السنام الواحد ، فقد كانت نسبة الحمل في النوق المستقبلة بعمر 11 سنة أو أصغر حمل أعلى بمقدار 10% من النوق المستقبلة بعمر أكثر من 11 سنة . وبالإضافة لذلك كانت نسبة الحمل في النوق المستقبلة البكر تعادل ضعف النسبة في النوق المستقبلة متعددة الولادة . ويرجع تأثير العمر والتكافؤ بشكل مؤكد إلى مشاكل التكاثر المتزايدة مع تقدم العمر وعدد الولادات ، كما تتأثر نسبة الحمل أيضاً بعدد الأجسام الصفراء في النوق المستقبلة حيث أن النوق المستقبلة التي لديها إلى ست أجسام صفراء عندها فرصة أفضل للحفاظ على الحمل ممن لديها واحدة أو اثنتين أو أكثر من ست أجسام صفراء .
3- تأثير التزامن :
وتكون نسب الحمل أعلى إذا تم نقل الأجنة في النوق المستقبلة التي باضت بعد يوم أو يومين من النوق المانحة التي باضت في نفس اليوم أو اليوم السابق . وفي إحدى الدراسات تم الحصول على نسب الحمل الأعلى عندما نقل الجنين إلى رحم مستلمة باضت بعد 1.5 يوم من النوق المانحة ، كما أن نقل الجنين إلى النوق المستقبلة من التي قد باضت قبل يوم واحد من النوق المانحة لم يسفر عن حمل أو كان الحمل منخفضاً جداً (10%) . ويسمح الفحص المتسلسل للإناث المستلمة كل ثلاثة أيام بعد النقل بأن نظهر أن السبب الرئيسي لهذه النسبة المنخفضة للحمل في النوق المستقبلة التي باضت بعد النوق المانحة كان الفناء المبكر للأجسام الصفراء ، ويرجع السبب في Luteolysis إلى طبيعة المرحلة اللوتنية وربما بسبب إطلاق Prostaglandi F2a الذي نتج عن معالجة العنق و/أو حساسية الغشاء المخاطي للرحم . وبالإضافة إلى ذلك فإن نسب الحمل في النوق المستقبلة ذات إباضة يوم إلى يومين قبل النوق المانحة والمستمرة في استلام حقن يومية من البروجسترون كانت مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها من النوق المانحة . وعلى أية حال فإن المعالجة بالبروجسترون يجب أن تستمر خلال الحمل الذي تصاحبه العديد من الأضرار ، وبالإضافة إلى حقيقة أن المعالجة اليومية بالبروجسترون تعتبر مستهلكة للوقت إلا أنها تحتوي على بعض المخاطر الصحية مثل تطور تقيح الرحم والمضاعفات في الولادة والتحضير الناقص للضرع. وعلى الرغم من أن بعض الباحثين قد ذكروا أن إناث جمل السنام الواحد يمكن أن يعطين ولادة آنياً حتى عندما تعطى بروجسترون ، إلا أننا لاحظنا وجود مشاكل عديدة بما في ذلك التمدد غير الكامل للعنق والفصل المشيمي غير الناضج والإنتاج غير الكافي للحليب في النوق المستقبلة التي تتلقى البروجسترون .
ومن أجل تجنب خسارة الحمل بسبب luteolysis فإننا نبقي النوق المستقبلة تحت معالجة البروجسترون الخارجي حتى يوم تشخيص الحمل ، وعند ذلك التشخيص يتم تقييم وجود وحجم الأجسام الصفراء. فإن كان الجسم بعد 15 يوماً من النقل بقطر 20 ملم أو أكثر يتم توقيف علاج البروجسترون ، أما إذا لم يكن هناك جسم أصفر أو أظهرت إشارات ارتداد فيتم إبقاء الحمل بالبروجسترون الخارجي وتعطى النوق المستقبلة جرعة eCG (1500 إلى 2000 IU ) من أجل زيادة تطور الموجة الجريبية الجديدة . ويتم إعادة فحص كل النوق المستقبلة التي تعطى eCG بعد أسبوع ، ويتم إعطاؤها hCG (3000 IU) إن وجدت جريبات بقطر أكثر من 12 ملم . وتسمح هذه التقنية بصنع أجسام صفراء جديدة للحمل في العديد من النوق المستقبلة التي كانت ستفقد ملها بسبب فناء الجسم الأصفر الأولي، كما أن هذه الطريقة تمنع الحاجة إلى الاحتفاظ بالحمل في النوق المستقبلة التي لا يوجد لديها أجسام صفراء بواسطة المعالجة اليومية بالبروجسترون الذي يتطلب عملاً مركزاً ويعتبر غالياً جداً.
4- تأثير طريقة النقل :
من المتوقع عادة أن تكون نسب الحمل بعد النقل الجراحي أعلى من النقل العنقي ، وهذا لا ينطبق بالضرورة على جمل السنام الواحد حيث تحققت نسب الحمل المقارنة (30 إلى 40%) بكلا الطريقتين .
5- تأثير جانب النقل :
اقترح العديد من الباحثين أن نقل الجنين إلى القرن الأيسر سيكون أكثر فائدة من النقل إلى القرن الأيمن ، ويستند ذلك على حقيقة أن كل حالات الحمل تقريباً تحدث في القرن الأيسر في الجمال بالإضافة إلى أن هناك فرق في إطلاق PGF2a ألفا بين القرنين الأيسر والأيمن . ويعتبر نشاط Luteolytic الخاص بالقرن الأيمن موضعياً أما ذلك الخاص بالقرن الأيسر فهو شامل ومحلي أيضاً ولذلك فإن وضع الجنين في القرن الأيسر سيمنع إطلاق Prostaglandi F2a ألفا في مجرى الدم ويمنع Luteolysis وإن كان الجسم الأصفر في المبيض الأيمن . ومن أجل تجنب التأثير Luteolytic من القرن الأيسر فإن بعض الباحثين يفضلون استعمال النوق المستقبلة ذات الإباضة من الجانب الأيسر وفي جمل السنام الواحد لم يوضح عملنا وعمل الآخرين تأثيراً هاماً عن جانب النقل فيما يتعلق بجانب الإباضة . وتتشابه نسبة الحمل ووجود Luteolysis بعد النقل في النوق المستقبلة في القرن الأيسر أو القرن الأيمن سواء كانت الجسم الأصفر على الجانب الأيمن أو اليسر .
6- تأثير معالجة الجنين :
لا توجد دراسات متوفرة عن الشروط المثلى ( الوسط ودرجات الحرارة ) لتخزين أجنة الجمال ، ويستعمل أكثر الباحثين العاملين في هذا الحقل التوجيهات التي اقترحت لأجنة الأبقار والخيول . ويتم تخزين الأجنة لأقل من ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة في صحون بتري الصغيرة التي تحتوي على وسط حفظ غني مختلف عن وسط المجموعة وبالإضافة إلى ذلك فإننا نغطي تلك الصحون لمنع تعرض الجنين المباشر للضوء ، وهناك بالتأكيد حاجة للبحث فيما يتعلق بشرط المعالجة القصوى لأجنة الجمال الطازجة .
7- تأثير الفني :
فشلت الدراسات في معرفة أي تأثير هام لخبرة الفني على نسب الحمل بعد النقل العنقي و تتراوح نسبة الحمل من 22% إلى 68% طبقاً لخبرة التقني ، ولعل ذلك يرجع إلى استعمال الطريقة المستقيمية المهبلية لتجاوز العنق والتي تعتبر أكثر صعوبة في تعلمها من الطريقة المهبلية المباشرة التي ليست ممكنة دائماً خاصة في النوق الصغيرة أو التي لم تحمل أو إذا كانت يد الفني ضخمة جداً على اختراق المهبل .
8- تأثير الفصل :
على الرغم من أن النوق قادرة على النشاط المبيضي طوال العام خاصة إذا كانت جيدة التغذية ، إلا أن نسب الحمل تكون صفراً إذا تم نقل الجنين خلال أشهر السنة الحارة . وقد لوحظ حدوث ذلك مع انخفاض نسبة الحمل وزيادة الموت الجنيني المبكر في كل من النوق التي تنقل إليها الأجنة وتلك التي تلقح من شهر مايو إلى سبتمبر . ويجب تجنب مثل هذه التواريخ في التكاثر ليس فقط بسبب الخصوبة الضعيفة ولكن أيضاً بسبب النمو الضعيف للمولود الحوار خلال هذه الشهور .
رابعاً : تجميد الأجنة
يمكن الحصول على الإمكانية الكاملة لنقل الجنين فقط إذا تم تطوير تقنيات أخرى مثل الحفظ بعيد المدى للجنين ( التجميد ) وتحديد جنس وإنتاج الجنين خارج الجسم الحي .
ويقدم حفظ الجنين بالتجميد العديد من الفوائد الواضحة مثل الخزن طويل الأمد للمادة الوراثية من الأنثى وسهولة النقل والتبادل الدولي وتحسين إدارة النوق المستقبلة .
(أ) إضافة الغليسيرول :
يتم اختيار الأجنة ذات النوعية الجيدة للتجميد ، ويتم غسلها في وسط الحفظ الطازج بدون غليسرول ثم تنقل بشكل متعاقب في أربعة أوساط مختلفة بتركيز متزايد من الغليسيرول (0.5 مليمتر 0.75 مليمتر ، 1.0 مليمتر ، و1.5 مليمتر ) . ويوضع الجنين في كل محلول لمدة 10 دقائق قبل نقله إلى المحلول التالي ذي التركيز الأعلى من الغليسيرول ، وعندما تكتمل كل هذه الخطوات يوضع الجنين في قصبة 0.25 مل ويترك للتوازن لمدة 10 دقائق أخرى قبل التجميد .
(ب) منحنى التجميد :
يتم استخدام مجمد أجنة مبرمج للتجميد المثالي لأجنة الخيول والأبقار ، وتتم مراقبة درجة الحرارة في القصبة بشكل مستمر لمتابعة منحنى تجميد مثالي . ويتم تبريد الجنين من درجة حرارة الغرفة إلى درجة حرارة الـ Seeding (-7 درجة مئوية ) بمعدل 0.3 إلى 1 مئوية/دقيقة . وتحفظ القصبات في درجة –7 مئوية لمدة عشر دقائق ويتم إدخال بلورات الماء (Seeding) بلمس القصبات بعصا باردة جداً ، ويلي تلك المرحلة تبريد أكثر للقصبة من درجة –7 مئوية إلى درجة –30 مئوية بمعدل –0.3 درجة مئوية /دقيقة ، وتحفظ القصبات في درجة –30 مئوية لمدة عشر دقائق ثم تغمس بشكل مباشر في النتروجين السائل.
(ج) التذويب وإزالة الغليسيرول :
يذوب الجنين بوضع القصبات في حمام ماء بدرجة 37 مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ويتم تفريغ محتوى القصبة في صحن صغير ويزال الغليسيرول بالمرور المتعاقب في وسط يحتوي على سكروز و/أو تركيز متناقص من الغليسيرول . ثم يوضع الجنين في قصبة جديدة وينقل إلى النوق المستقبلة بنفس الأسلوب الموصوف للجنين الطازج .
(د) النتائج والتطورات المستقبلية :
أثمرت التجارب الأولية للجنين المجمد لجمل السنام الواحد نتائج حمل ضعيفة جداً (10%) ، وعلى أية حال فإن البحث ما يزال مستمراً لتحديد الظروف الأفضل ( مرحلة الجنين ، الوسط ، طبيعة وتركيز المادة الحافظة (Cryoprotectant ) ، ومنحنى التجميد ) لتجميد الجنين في هذه الفصيلة . وتعتبر العقبة الرئيسية لتجميد الجنين في جمل السنام الواحد هي الحجم الكبير بشكل نسبي للجنين المجموع من الرحم ، وقد ميز حجم الجنين كعامل رئيسي في نجاح تجميد الجنين الذي يكون حجمه أكبر من 250 عملية التجميد . ولسوء الحظ فإن جمع الجنين قبل التفقيس ليس سهلاً في جمل السنام الواحد .
خامساً : التكاثر الاصطناعي ومعالجة الجنين
يعتبر التخصيب المساعد حقلاً جديداً بشكل نسبي في الطب البيطري الذي يكسب الكثير من الاهتمام كأداة بحث وكطريقة إعادة إنتاج بديلة للأنسال أو الفصيلة المعرضة للخطر، وأيضاً لمعالجة بعض حالات عدم الخصوبة في الحيوانات الثمينة . وتتضمن تقنيات إعادة الإنتاج المساعدة التخصيب خارج الجسم الحي (IVF) ونقل الأمشاج داخل قناة فالوب (GIFT) ، وبعض المعالجات للجنين أو الأمشاج مما يسمح بزيادة عدد النسل خارج الجسم الحي ( الشطر والاستنساخ ) ونقدم هنا مناقشة للفوائد وعملية هذه التقنيات في الجمال على الرغم من أن الأبحاث التي نشرت في هذه الفصيلة محدودة .
(أ) التخصيب خارج الجسم :
لا يزال التخصيب خارج الجسم الحي في المرحلة التجريبية في الجمال ، فقد تم إنتاج الجنين خارج الجسم الحي في حيوانات اللاما . وعلى أية حال لا توجد أي تقارير حتى الآن عن نسل حي من جنين أنتج خارج الجسم الحي . ومن الواضح أن هناك نقص في البيانات العلمية التي استعملت لتحضير المني وخلية البيضة مأخوذة من الأعمال التي تمت في فصيلة الأبقار . وتعتبر نسب نجاح التخصيب خارج الجسم الحي منخفضة جداً ولم يتم الحصول على جنين حتى الآن بالمني المقذوف ، وعلى أية حال وبسبب فوائده المتعددة فمن المتوقع أن يتطور هذا المجال بشكل سريع جداً ويصل إلى الإمكانية التجارية.
ويقدم التخصيب خارج الجسم الحي بضعة فوائد علمية وتكاثرية وطبية يمكن تلخيصها كالتالي :
- يمكن معالجة عدم الخصوبة في الحيوانات الثمينة ، ففي النوق يمكن استخدام التخصيب خارج الجسم الحي لإنتاج جنين من حيوانات تعاني من انسداد قنوات الإباضة وتعاني أمراضاً رحمية أو عنقية حادة . وكذلك بالنسبة لذكور بنوعية مني منخفضة جداً فيمكن أن يعاد الإنتاج باستعمال تقنيات مثل حقن المني ( microinjection) .
- يسمح للعلماء أن يكون عندهم القدرة على الوصول إلى مراحل تطور الجنين والتي تكون صعبة جداً في الحيوان الحي ، وبذلك تصبح مثل هذه التقنيات التي تتطلب جنيناً صغيراً في مرحلة التعلق بقناة الرحم من أجل تجميده أو شطره أو استنساخه أمراً محتملاً .
- يلبي الحاجة الضرورية للطرق المعتمدة لتقييم القدرة التخصيبية للمني .
- يعرض نموذجاً لدراسة التخصيب والتطور الجنيني .
- يسمح باستعمال مادة وراثية من النوق التي ماتت إذا تم إدخال برنامج لحفظ خلية البيضة ، حيث جمع خلية البيضة من الحيوانات التي ماتت مؤخراً أو عندها أمراض طرفية وتخزينها في حالة تجميد حتى الاستعمال . ويعتبر ذلك مهماً خاصة لحفظ مادة وراثية من حديقة الحيوانات أو الحيوانات البرية .
- يسمح باستعمال المني المحدد الجنس لإنتاج جنين بجنس معين .
ويعتمد نجاح التخصيب خارج الجسم الحي على بضعة عوامل مثل الأصل وتحضير خلية البيضة والمني وظروف التخصيب وتطور الجنين . ومن أجل أن تتمكن خلية البيضة والمني من استكمال التخصيب فيجب أن تخضع إلى التغييرات الكيمياوية الحيوية والتشكيلية التي تسمى النضوج لخلية البيضة ، والقدرة (Capacitation) وتفاعل الأكروزوم ( acrosome ) للنطف .
1- جمع خلية البيضة والنضوج :
هناك مجموعتان من الطرق المتوفرة لجمع خلية البيضة والتي يمكن تطبيقها على الجمال : الأولى جمع خلية البيضة في الجسم الحي والثانية جمع خلية البيضة بعد استئصال المبيض . وتعتبر الطريقة الأولى الأكثر رغبة إن كانت الأنثى ستستعمل بشكل مستمر في هذا البرنامج . وعلى أية حال فإن جمع البيضة بعد استئصال المبيض أو التشريح بعد الوفاة قد تكون التقنية الأكثر كفاءة للعمل التجريبي .
أ- جمع خلية البيضة في الجسم الحي :
يمكن أن يتم جمع خلية البيضة من الحيوان بشكل جراحي أو عن طريق توجيه الجريب بالموجات فوق الصوتية ، وقد تم تجربة الجمع الجراحي لجريب كامل في إناث متعددة الإباضة بـ eCG أو FSH . ويتم الوصول إلى المبيض عن طريق شق البطن وتزال كل الجريبات البالغة (10 إلى 15 مليمتر ) من سطح المبيض وتشرح في المختبر . وتعمل هذه التقنية جيداً بشكل نسبي إذا لم يتم حث الحيوانات أكثر من اللازم (overstimulated) ولكنها ليست عملية للإنتاج المتكرر لخلية البيضة من نفس الأنثى . ثم تزال خلية البيضة من الجريب بالتشريح تحت المجهر ، وتكون تلك الخلية عادة في مرحلة متقدمة من النضوج ، خاصة إذا تمت العملية من 12 إلى 24 ساعة بعد حث الإباضة مع eCG . وعلى أية حال فإن نسبة الإنتاج يمكن أن تكون منخفضة جداً بعد هذه المعالجة لأن الجريبات تصبح لينة جداً وتنزف بشكل سهل .
وأفضل أسلوب في تقنيات جمع خلية البيضة في الجسم الحي هو توجيه الجريب بالموجات فوق الصوتية ( Transvaginal ultrasound ) حيث يتم تخدير الأنثى وإعدادها مثل طريقة جمع الجنين مع تخدير موضعي منخفض . ويتم إدخال مسبر مهبلي ( curvilinear أو مسبر القطاع ، 5 أو 7.5 ميغاهرتز ) مربوط إلى مقبض طويل ( 30 إلى 40 سنتيمتراً ) في المهبل ، ويتم معالجة المبيض بشكل مستقيمي ويوجه نحو المسبر . وعند تمييز الجريبات وتثبيتها يتم إدخال إبرة طويلة خلال المسبر تتقدم ببطء خلال الحائط المهبلي ويتم سحب المحتوى الجريبي باستعمال مضخة شفط . وتتطلب هذه التقنية معالجة قليلة وتعطي نسبة الإنتاج من 40 إلى 50% .
ب- جمع خلية البيضة بعد استئصال المبيض أو التشريح بعد الوفاة :
تستخدم أغلب الأبحاث حول IVF خلية البيضة المأخوذة بشكل مباشر من المبيض بعد الذبح أو بعد استئصال المبيض ، حيث يغسل المبيض بالملح ويوضع في ترمس في درجة 38 مئوية وينقل خلال 30 دقيقة إلى المختبر حيث يشطف ويوضع في مضادات حيوية وملح. وتجمع عقد خلية البيضة (COC) بعد ثرم المبيض بنصل آلة حلاقة وملاحظته تحت مجهر تشريح ، وتغسل في محلول معدل (Tyrode hepes talp ) يحتوي على :
114 ملم Nacl : و3.1 ملم KCl ، و2.0 NaHCO و0.3 مليمتر NaH2PO4 و10 مل صوديوم ، و2 Ca Cl lactate MgCl 0.5 ، مليمتر 2 Hepes 10 ، مليمتر ) أكمل بمل 3 BSA mg3 / كسر M25 , V صوديوم Pyruvate ومل gentamycine 50/g كبريتات.
وأثمرت هذه التقنية عن معدل 6.4 خلية بيضة في اللاما .
ج- تقييم خلية البيضة :
يتم فحص COC لتحديد مرحلة النضوج خاصة توسع خلايا الركام ، ويكون لدى خلية البيضة التي جمعت قبل الإباضة مباشرة طبقة خلية ركام متوسعة . وتكون تلك التي تم الحصول عليها بشق المبيض من مجموعة متباينة من الجريبات وعادة في مراحل مختلفة من النضوج . ويعتبر اختيار خلية البيضة قبل الاحتضان مهماً جداً لأنه وجد في اللاما أن 17 إلى 52% من خلية البيضة تتحلل بعد الإنتاج من الجريب .
د- النضوج خارج الجسم الحي :
تبقى خلية البيضة في معظم الثدييات في مرحلة تضاعف الصبغيات من الدور الانتصافي الأول ( Meiotic prophase ) خلال تطور الجريب ، وعند اقتراب الإباضة تخرج خلية البيضة من مرحلة خمول هذه لتستمر في الانقسام ، وهذا التفاعل في طور الانقسام يسمى نضوج خلية البيضة .
وعادة يستخدم معياران لوصف مرحلة نضوج خلية البيضة : السيتوبلازميك ( Cytoplasmic) ونضوج النواة ، ويتمثل الأول في هجرة الحبيبات اللحائية نحو غشاء البيضة ( Oolema ) واكتساب الزغيبات ( microvilli) على سطح الخلايا . أما نضوج النواة فيتمثل بظهور حويصلة ودليل النشاط الانقسامي ( metaphase وanaphase1 وmetaphase2 ).
وقد تم تحقيق النضوج خارج الجسم الحي في اللاما بالاحتضان في درجة 38.5 مئوية تحت 5% من ثاني أوكسيد الكربون في هواء عالي الرطوبة في خلية مزروعة بوسط TCM 199 مكملة ب 0.5 نانوجرام /مل oFSH ، و5 نانوجرام /مل oLH ،و1 نانوجرام /مكل estradiol 17 ، و25 نانومتر Pyruvate و10% مصل متبرع عجل مخصي . وتحت هذه الظروف من الاحتضان فإن 62% من خلية البيضة تكون في المرحلة الثانية ( Metaphase II) بعد 36 ساعة من الزرع .
2- تحضير المني :
في نهاية عملية تكون الخلايا المنوية لا تكون النطف قادرة على التخصيب ، ويتم اكتساب هذه الخاصية في البربخ ، وتتم هذه العملية التي تسمى النضوج البربخي خلال عبور البربخ وتكتمل عندما تصل النطف إلى ذيل البربخ .
وإحدى الخصائص الرئيسية للنطف البالغة هي اكتساب الحركة والتي تنتج عن التغييرات الكيمياوية الحيوية في غشاء البلازما ، وتتعلق هذه التعديلات بشكل رئيسي بالبروتين السكري والمادة الشحمية للغشاء وخاصة كوليسترول التكامل . وحتى بعد هذا النضوج فإن النطف لا تصبح قادرة على التخصيب حتى تتعرض للمنطقة التناسلية في الأنثى لبعض الوقت ، وبعد الانتهاء من ذلك تسمح هذه العملية والتي تسمى القدرة Capacitation للتلقيح في أن تصبح قادرة على الارتباط بالمنطقة الشافة لخلية البيضة . والنتيجة الرئيسية لهذه العملية هي التعديل أو إزالة المواد التي تكثفت في غشاء بلازما النطف خلال العبور البربخي أو بعد الاتصال بالبلازما النووية . وتعمل هذه التعديلات على إعداد خلية الحيوان المنوي على المرور بتغييرات أخرى خاصة في مستوى الأكروموزوم ( acrosome reaction ) والتي تعد التغييرات النهائية المطلوبة لخلية الحيوان المنوي لكي يخترق غلاف خلية البيضة .
وتحدث مرحلة اكتساب القدرة في أغلب الفصائل في الجزء الأقصى لبرزخ الأنبوب الرحمي ، حيث أن الآليات التي تسيطر على تلك العملية في هذا المستوى غير مفهومة بالكامل . وقد تم التعرف على بعض المواد الموجودة في قناة البيض على أنها عوامل مساعدة لاكتساب القدرة وتتضمن :
Hypotaurine , taurine , glucosaminoglycans , fucosidase , arylsulfatase , neuraminidase , proteinase , glucuronidase , amylase acetylhexosaminidase .
ومن المعروف منذ 30 سنة أن التغييرات التي حصلت في القدرة يمكن الحصول عليها خارج الجسم الحي في الأوساط المعرفة بشكل كيميائي ، أما في الجمال فليس هناك دراسات على القدرة لرد فعل الأكروموزوم ( Capacitation و acrosome reaction ) في المني المقذوف . وفي الدراسات الوحيدة على IVF في اللاما استخدم المني من ذيل البربخ التي تعتبر أسهل في اكتساب القدرة من النطف المقذوفة . ويتم غسل الحيوان المنوي البربخي بالتمخض ( Centrifugation) في وسط TALP مكون من :
100 ملم NaCl ، و3.1 ملم KCl ، و25 ملم Na HCO3 ، و0.3 ملم NaH2PO4 ، و21.6 ملم صوديوم ، و2 ملم CaCl2 ، و0.4 ملم MgCl2 ، و10 ملم Hepes ، و1.0 ملم صوديوم ، و3 مغ/مل BSA ، و50 نانوجرام /مل كبريتات gentamicin .
ويتم تمخيض المني مرتين في 300 غ لمدة خمس دقائق ثم تفصل الحيوانات المنوية المتحركة وغير المتحركة على عمود Percoll متقطع الكثافة بالتمخيض في 1000 غ لمدة 30 دقيقة .
3- التخصيب خارج الجسم وتطور الجنين :
تم إجراء التخصيب خارج الجسم الحي بنجاح في اللاما حيث تم حضانة المني البربخي الممخض من قبل في وسط TALP بخلية بيضة متعرية أنضجت خارج الجسم الحي بوجود 5 نانوجرام/مل من Heparin في وسط تخصيب هادئ مكون من :
NaCl 114.0 مليمتر ، 3.2 مليمتر Nah- , KCL co25.0 مليمتر3 NaH 0.34 , PO 2 10 ، صوديوم مليمتر مليمتر 2.2.0 CaCl lactate MgCl 0.5 مليمتر 0.25.2 صوديوم مليمتر6 مل Pyruvate/mg حر حامضي سمين BSA ، ومل gentamicin 50/g كبريتات.
وتم الحصول على نسبة تخصيب قدرها 29% باستعمال هذه التقنية ولكن 6% و4.7% فقط من البيض المخصب وصل على التوالي إلى مرحلة الكيسة الرومية المبكرة والتفقيس بعد الزرع المشترك مع خلية متعلقة بقناة الرحم في اللاما ، وليس هناك شك أن التخصيب خارج الجسم يمكن أن ينجز في الجمال ، وعلى أية حال فمن المهم أن يطور هذا الإجراء بالمني المقذوف .
(ب) المعالجة وتقنيات التكاثر الاصطناعي الأخرى :
إن نقل الجنين والتخصيب خارج الجسم الحي يفتحان آفاقاً جديدة للتحسين الوراثي في الجمال ، ويمكن أن ترتفع قوة هذه التقنيات إذا تمت معالجة الجنين قبل النقل . وتهدف أغلب إجراءات معالجة الأمشاج أو معالجة الجنين إلى زيادة عدد الأجنة التي عندها شكل وراثي متماثل ( توائم ثنائية أو رباعية أو استنساخ ) ، أو تخصيب خلية بيضة بمني من الذكور غير الخصبة ( حقن المني بالمجهر ) ، أو إنتاج جنين جنس معين ( تحديد الجنس ) ، أو أكثر من ذلك الاستنساخ الحقيقي لحيوان متفوق .
1- نقل المشيج داخل قناة فالوب :
يتضمن نقل الأمشاج داخل قناة فالوب وضع خلية البيضة التي جمعت من النوق المانحة في قناة رحم مستلم مفقس أو ملقح ( قناة البيض ) ، وبالتالي فإن التخصيب وتطور الجنين المبكر يحدث في النوق المستقبلة . ويمكن نقل العديد من خلية البيضة بهذا الأسلوب ويتم تخصيبها ثم تؤخذ في مرحلة الكيسة الأرومية بشطف الرحم بعد 6.5 إلى 7 أيام .
2- شطر الجنين :
يتضمن شطر الجنين قص الجنين إلى نصفين أو أربعة أرباع لإنتاج أجنة جديدة عندها نفس الصفات الوراثية تماماً ، حيث يتم شطر الجنين باستعمال شفرة مجهرية (Microblade ) ويثبت الجنين في أحد الأطراف بالامتصاص بينما يقطع النصل في المنتصف. ويجب أن تتم هذه التقنية مع التوتية (البيضة الملقحة قبل انشقاقها ) أو الكيسة الأرومية المبكرة التي يصعب الحصول عليها في الجمال إلا إذا تم شطف الأجنة من قناة المبيض .
3- نسخ الجنين :
بشكل نظري فإن كل قطعة أرومية ( blastomere ) من الجنين قادرة على إعطاء جنين كامل جديد إذا توفرت شروط التطور الصحيحة ، وبالتالي يمكن إعادة إنتاج الجنين بشكل غير محدد مع كل قطعة جديدة . وتم تطبيق هذه التقنية على الماشية وجنين الأغنام وتم الحصول على بضعة أنسال .
وعلى أية حال فقد ذكرت العديد من المشاكل مع الحمل باستعمال هذا الجنين مثل عجول كبيرة بشكل غير طبيعي أو تمشيم شاذ .
4- جنس الجنين :
يعتبر اختيار جنس الجنين قبل النقل مثار اهتمام العديد من أنظمة الإنتاج ، خصوصاً في حالة جمل السباق للسنام الواحد ، ويمكن تصنيف التقنيات المتوفرة التي تسمح باختيار جنس الجنين في مجموعتين :
1 ) تلك المستندة على فصل النطف الحاملة لـ X و Y ( مني الجنس ) واستعمال المجموعة المنتقاة لتعديل نسبة الجنس .
2) تلك المستندة على تحديد جنس الجنين بعد الجمع ، ونقل تلك التي لديها الجنس المطلوب فقط .
أ- فصل خل
نسبة إنتاج الجنين :
تتغير نسبة إنتاج الجنين إلى حد كبير في الجمال وتعتمد على العديد من العوامل مثل معالجة الإباضة المتعددة والخصوبة والإدارة وموعد الجمع والخبرة . وتتراوح نسبة إنتاج الجنين في الناقة من 114% إلى 384% وتتأثر بعدة عوامل .
أ- إناث معطية بدون إباضة متعددة :
يمكن القيام بجمع الأجنة في الحيوانات التي لا تعتبر ذات إباضة متعددة إذا كان عدد النوق المستقبلة محدوداً. وفي جمل السنام الواحد تم الحصول على نسبه بلغت 85% في وحيدة الإباضة و165% في مزدوجة الإباضة مما يعني أن التخصيب يمكن أن يكون عالياً جداً إذا تمت إدارة التكاثر بشكل جيد . وكانت نسبة الإنتاج أعلى في النوق مزدوجة الإباضة وضعيفة في وحيدة الإباضة . مما يعني أن الإباضة المضاعفة لا تؤثر على نسبة الخصوبة وبقاء الجنين حتى اليوم السابع بعد الإباضة . وفي جمال أميركا الجنوبية بلغت نسبة الإباضة المزدوجة حوالي 10% ، وترتفع نسبة الإباضة المزدوجة إلى 20% في الحيوانات التي حفزت باستخدام hCG أو GnRH .
ب- إناث معطية بإباضة متعددة :
تعتبر نسبة إنتاج الجنين في النوق المانحة بإباضة متعددة متغيرة إلى حد كبير (114 إلى 384%) ، وقد يرجع السبب في هذا التغير العالي إلى العديد من العوامل بما في ذلك فشل الإباضة أو اللوتنة الشاذة أو نسبة تخصيب ضعيفة أو عدم انتظام تطور الجنين ونقله . ويمكن أن يحدث فشل الإباضة إذا لقحت الحيوانات في وقت مبكر جداً ( قبل أن تصل الجريبات حجم البلوغ ) أو إذا كان هناك استجابة منخفضة لـ LH بعد التلقيح . ولتخفيف هذه المشاكل يجب ألا تلقح النوق المانحة قبل أن يصبح قطر الجريبات 10 ملم على الأقل وليس أكثر من 18 ملم ، ويجب أن تعطى الحيوانات متعددة الإباضة أيضاً حقن hCG (IU 3000) عند التكاثر أو خلال 24 ساعة منه .
ويمكن لنوع معالجة الإباضة المتعددة أن يكون له تأثير كبير على نسبة إنتاج الجنين ، ففي دراسة ذات أثر رجعي على العديد من نتائج الإباضة المتعددة أنتجت النوق المعالجة بـ FSH أجنة أكثر (417% تلقيح طبيعي و188% للاصطناعي ) من النوق المعالجة بـ eCG وتأثيره الطويل الأمد الشكل (11).
.
الشكل (11) a-f مراحل تطور ودرجات جنين الناقة
الجدول (4) تصنيف الأجنة .
الصفات
الدرجة
نوعية جنين ممتازة ، الحجم متناسب مع مرحلة الجمع بالنسبة للإباضة . قبل اليوم الثامن يجب أن يكون كروياً بشكل كامل مع سطح ناعم .
الدرجة I
جنين جيد مثل السابق مع بعض الشذوذ في الكفاف وخلايا ناتئة قليلة جداً
الدرجة II
نوعية متوسطة ، جنين صغير مع بقع غامقة اللون وكفاف شاذ وبعض الخلايا الناتئة
الدرجة III
أجنة هابطة تظهر منطقة مظلمة من التحلل وخلايا خارجة كثيرة .
الدرجة IV
غير قابل للنقل ، أجنة هابطة ومظلمة أو أجنة معاقة ، وكل المراحل التي جمعت من الرحم كانت أصغر من الكفاف وإباضة غير مخصبة .
الدرجة V
تأثير توقيت الشطف على نسبة إنتاج الجنين :
من المعروف جيداً في الوقت الراهن في الجمال أن الجنين لا يصل إلى الرحم حتى اليوم السادس أو السادس والنصف بعد الإباضة ستؤدي إلى نسبة إنتاج منخفضة. وعلى أية حال يتم الحصول على أفضل نسب لإنتاج الجنين عندما يتم كشط النوق المانحة في اليوم السابع أو بعد ذلك . وفي دراستين منفصلتين بلغت نسب الإنتاج 114% و179% و267% بعد الكشط في اليوم السادس واليوم السادس والنصف واليوم السابع بعد الزواج ، كما بلغت 60% و157% و175% و200% و300% للجمع في اليوم السادس واليوم السادس والنصف واليوم السابع واليوم السابع والنصف واليوم التاسع على التوالي . وكان تأثير تاريخ الجمع على نسب إنتاج الجنين أكثر وضوحاً في النوق متعددة الإباضة بسبب التأخير المحتمل في الانتقال بقناة الرحم والتخصيب ، وهذه الملاحظة المانحة بعد جمع الجنين . وفي الحقيقة فإن العديد من النوق المانحة تصبح حامل بعد الكشط مرتين لمدة 12 إلى 24 ساعة .
الكشط الخطأ :
يمكن أن تؤدي عدم توفر الخبرة اللازمة للفني إلى العديد من حالات الكشط الفاشلة ، ويكون لدى معظم المهنيين من عديمي الخبرة صعوبات في تقدير موقع وسط الكفة ويمكن أن يذهب بعيداً جداً في القرن الرحمي ، ولذلك يؤدي وضع الكفة بشكل سيء إلى الانقلاب وفقدان السائل في التجويف المهبلي ، كما أن إدخال القسطرة في القرن الأيسر قد يكون صعباً للفني الأعسر والعكس بالعكس . ويمكن أن تؤدي المعالجة القاسية أيضاً إلى النزيف مما يجعل التعرف على الجنين صعباً جداً
فشل الإباضة :
ينتج فشل الإباضة عن نقص أو عدم إطلاق LH ، وقد لوحظ في النوق فشل الإباضة في 15 إلى 20% من النوق المانحة حتى وإن تم التقيد بمعايير قرار التلقيح . ويعتبر فشل الإباضة أكثر شيوعاً في الحيوانات ذات الإباضة المتعددة ويظهر في النمو الكبير للجريبات غير الإباضية . ويعني حدوث فشل الجريبات في الإباضة حتى وإن حقنت النوق مع hCG أو GnRH أن بعض الجريبات ينقصها الاستقبال الملائم لهذه الهرمونات . وفي بعض الحالات ترتد الجريبات بعد التكاثر بدلاً من الإباضة ، وقد يكون السبب في ذلك نسبة غير صحيحة بين LH و FSH خلال معالجة الإباضة المتعددة .
ويمكن أن تحدث استجابة ضعيفة للإباضة أيضاً عندما يستند قرار التكاثر على تلقي الأنثى ، وذلك بسبب حقيقة أن النوق متعددة الإباضة يمكن أن تصبح متلقية حتى في وجود جريبات صغيرة غير ناضجة تفشل في الإباضة . ويحتمل أن يكون ذلك هو السبب في أن البدء مبكراً في جمع الجنين في الناقة حقق نسبة منخفضة جداً في إنتاج الجنين وفي النوق التي عوملت بـ eCG يمكن أن ينتج فشل الإباضة عن لوتنة مبكرة للجريبات .
نقص الخصوبة :
يعتبر فشل التخصيب مشكلة عامة في الحيوانات ذات الإدارة السيئة ، وقد سجل التخصيب القليل أو غير الكامل في بعض الذكور ذات مني ذي نوعية منخفضة . وفي إحدى الدراسات فشلت كل النوق التي لقحت إلى ذكر كان عنده تركيز مني منخفض ( أقل من 20 مليون /مل ) في أن تنتج جنيناً . وهناك عوامل أخرى أيضاً يمكن أن تدخل أسباب في التخصيب الضعيف ونسب إنتاج الجنين ، فقد لاحظنا حالة نقص كامل للتخصيب على الرغم من التركيز الطبيعي لمني الذكر وحركته .
وتؤثر بضع مشاكل مرضية مثل التهاب البوق الرحمي والتهاب بطانة الرحم على التخصيب وبقاء الجنين وانخفاض إنتاج الأجنة في النوق المانحة . ففي حالة التهاب بطانة الرحم يكون سائل الكشط عادة سميكاً أو غامقاً ويحتوي على بقايا الجنين يتأثر أيضاً بعمر الأنثى المانحة ، فقد وجد في دراسة على جمل السنام الواحد أن إنتاج الجنين كان أعلى في النوق المانحة بعمر 12 سنة أو أكثر من النوق الأصغر (285% مقابل 149%) . وقد أنتجت النوق عديدة الولادة أجنة أكثر من النوق التي لم تحمل من قبل (353% مقابل 121%) . وقد يكون تأثير العمر ناتجاً أيضاً عن وجود متزايد لحث المبيض في النوق الأصغر .
وقد يعاق تخصيب البيض ونقل الجنين أيضاً بسبب وجود جريبات إباضية كبيرة ، فقد وجد أن نسبة إنتاج الجنين كانت أعلى في النوق بدون جريبات غير إباضية (220%) من النوق التي لديها تلك الجريبات (148%) ، وهذا يعني أن المعالجة بالبروجسترون قادرة على تنظيم موجة الجريب وزيادة الاستجابة للجريبات .
ولوحظت أيضاً نسب أقل لإنتاج الجنين بسبب تخصيب ضعيف عندما يتم تلقيح النوق المانحة بشكل اصطناعي ، وتكون نسب الإنتاج في النوق المانحة ذات التلقيح الطبيعي أعلى بشكل متوافق (299%) من النوق الملقحة صناعياً بالمني الطازج (199%) أو المني (124%) ، ولم تجر أي دراسة على نسب إنتاج الجنين بعد التلقيح الصناعي بالمني المجمد . وقد يكون التأثير السلبي للتلقيح الصناعي على نسبة إنتاج الجنين ناتجاً عن حث غير كاف للإباضة أو نسبة تخصيب ضعيفة .
أجهزة سيئة :
يجب التأكد من سلامة كل الأجهزة المستخدمة في الكشط قبل الاستعمال , وكانت أغلب الأجنة التي جمعت من الرحم في النوق في مرحلة الكيسة الأرومية وهذا يجعلها عادة أكثر عرضة للالتصاق بالسطوح القاسية وبالحطام الخلوي ومن السهل أن تفقد خلال المعالجة.
3- تقييم الأجنة :
تكون الأجنة المسترجعة من الرحم في النوق عموماً في مرحلة الكيسة الأرومية ، ويتغير حجم الجنين إلى حد كبير في المراحل المختلفة بعد الإباضة .
ويدخل الجنين في ناقة السنام الواحد إلى الرحم بعد 6 إلى 6.5 يوم من الإباضة في مرحلة الكيسة الأرومية المبكرة مع منطقتها الشافة . وعلى أية حال يبدو أن مدة هذه المراحل تكون قصيرة جداً وأغلبية الأجنة التي جمعت في اليوم 6.5 أو 7 لقحت مسبقاً في اليوم السابع. وفي إحدى الدراسات فإن 75% من الأجنة التي جمعت في اليوم السابع بعد التلقيح كانت في مرحلة الأرومية . و كانت الأجنة التي استرجعت من ناقة السنام الواحد بعد سبعة أيام من الزواج متغيرة جداً في الحجم ويتراوح قطرها بين 500 إلى 175 نانومتر ، وقد يرجع هذا التغير في مرحلة التطور إلى الانتشار الكبير للإباضة في الحيوانات متعددة الإباضة . وتستمر الأجنة المفقسة في النمو بشكل سريع وتصبح مرئية بشكل سهل بالعين المجردة مع توسعها ، ثم تبدأ في فقدان شكلها الكروي في اليوم 8.5 أو 9 بعد الإباضة وتصبح مطوية .
ويصنف نظام التقييم المستعمل من قبل أكثر الباحثين الجنين في خمس درجات طبقاً لخصائصها النسيجية ومراحل تطورها ( الجدول 4) . ويجب أن يبحث المتخصص عن الشذوذ مثل القطعة الأرومية المقذوفة وإشارات الانحطاط ( مناطق مظلمة ) وأشياء نسيجية شاذة واضحة مثل الطوي أو التجعد .
(ج) إدارة النوق المستقبلة :
تعتبر نوعية النوق المستقبلة هي العامل الأكثر أهمية في نجاح أي برنامج لنقل الأجنة ، أما العاملان الرئيسيان لاختيار النوق المستقبلة لنقل الجنين فهما فحص مشاكل الإنتاج والصحة والتحضير أو التزامن مع النوق المانحة .
1-معايير اختيار النوق المستقبلة :
يتم الحكم على النجاح الإجمالي لبرنامج نقل الأجنة بناء على نسبة الولادة ونسبة بقاء ونمو النسل . وبالتالي فإن معايير اختيار النوق المستقبلة في برنامج نقل الأجنة يجب أن تتضمن خصوبة جيدة وحمل طبيعي وإرضاع طبيعي . وفي برنامجنا لنقل الأجنة تضاعفت نسبة النجاح عندما تم تطبيق برنامج صارم لاختيار النوق المستقبلة . ويمكن تلخيص هذا البرنامج كالتالي :
التاريخ : يجب أن تكون النوق المستقبلة صغيرة ( العمر أقل من 12 سنة ) ، وكان لها على الأقل حمل طبيعي واحد بولادة طبيعية ، وتكون أما حبلى حالياً أو مفطومة مؤخراً .
الجدول (5) نتائج نقل الأجنة ، جمعت من إناث غير فائقات الإباضة من 7 إلى 7.5 يوم بعد التزاوج .
85%
نسبة الإباضة
95%
نسبة الاسترجاع
1.16
معدل الجنين لكل أنثى
42%
نسبة الحمل بعد النقل
4.1
المدة بين الجمع والتزاوج (أيام)
21
المدة بين الجمعين (أيام)
8
عدد مرات الجمع في الموسم
يجب أن يركز الفحص العام للمستقبلة على الموافقة وشرط الجسم الجيد وعلى أعراض الضعف أو الأمراض المعدية . ويجب كذلك فحص كل النوق المستقبلة المحتملة ضد داء البروسيلات أو الحمى المالطية وداء المثقبيات .
ويجب فحص قابلية التكاثر على النوق المستقبلة المحتملة بما في ذلك الجس والتصوير فوق الصوتي للمنطقة التناسلية وطبيعة الرحم والفحص المهبلي وفحص الضرع .
وبالإضافة إلى الفحص المنتظم للمنطقة التناسلية يجب فحص عينة رحمية طبيعية من أي أنثى لا يوجد لها سجل كامل .
2- التزامن مع النوق المانحة :
من المعروف بشكل جيد في الوقت الراهن أن فرص بقاء الجنين تعتمد بشكل كبير على طبيعة الغدد الصماء لدى النوق المستقبلة ، ومن أجل هذا الأمر يعتبر التزامن
الجدول (6) نتائج برنامج نقل الأجنة.
Inhibin
eCG
FSH
80
70
70
الاستجابة للإباضة المتعددة
80
80
80
% الإباضة
2إلى 25
2إلى 25
2إلى 25
معدل الإباضة (تقدير الهيئات الصفراءة بالتصوير فوق الصوتي)
1 إلى 8
0 إلى 19
0إلى 21
عدد الأجنة التي جمعت مراحل الأجنة عند الجمع
100
90
90
%أرومة مخصبة
-
6
8
%أرومة مبكرة
-
4
2
%غير مخصبة
49
38
42
نسبة الحمل بعد النقل
بين الدورة المنتجة للمتبرع والنوق المستقبلة هاماً جداً . وتوضح نتائج نقل الجنين في جمل السنام الواحد أن النوق المستقبلة الأفضل يجب أن تلقح في نفس يوم المانحة أو بعدها بحدود ساعة .
ويمكن معرفة تزامن البيئة الرحمية بين النوق المانحة والمستقبلة من خلال تزامن الإباضة أو بالتحضير الكامل بالعلاج الهرموني .
أ- تزامن تطور الجريب والإباضة :
يمكن أن يتم تزامن الإباضة بين النوق المانحة والنوق المستقبلة باستعمال طريقتين : إما اختيار النوق المستقبلة من مجموعة عشوائية ، أو تحضير النوق المستقبلة بأسلوب يتزامن فيه تطور الجريب مع النوق المانحة .
وفي الأسلوب الأول يتم فحص مجموعة إناث مستقبلة ذات دورة بعد 24 ساعة من تلقيح النوق المانحة ويتم معالجة كل النوق التي عندها جريب بالغ ونغمة رحمية مع GnRH أو hCG . وتعتبر هذه الطريقة في اختيار النوق المستقبلة على أية حال مستهلكة للوقت ويمكن أن تستخدم فقط إذا كان عدد النوق المانحة حدوداً أو إذا كانت النوق المانحة غير متعددة الإباضة .
وتمت محاولة التزامن في التطور الجريبي بين النوق المانحة والنوق المستقبلة باستعمال Progestagen بدرجات متفاوتة من النجاح ، كما تمت محاولة تزامن النوق المستقبلة باستخدام أدوات إطلاق البروجسترون داخل المهبل ( PRID سبعة أيام ) في جمل السنام الواحد لكنها لم تكن ناجحة . وقد استجابت 39% و28% من النوق فقط للإباضة بعد استلام 3000 hCG IU و20غ Buserelin بعد إزالة أدوات PRID . وقد كان لدى نسبة كبيرة من النوق مستويات عالية من البروجسترون قبل المعالجة مع hCG أو نظير GnRH واعتبرت كأن لها إباضة آنية كاستجابة للبروجسترون . ولا يرجع السبب في البروجسترون المرتفع في الحيوانات غير المعاملة إلى الإباضة التلقائية كما اقترح من الباحثين وإنما إلى وجود جريبات لوتنية إباضية والتي تتطور في 30 إلى 40% من إناث جمل السنام الواحد غير الفاقسة .
ويتم الحصول على أفضل النتائج لتزامن الإباضة عندما يتم حث النوق المستقبلة للإباضة باستخدام hCG (3000 أو 5000 IU ) أو Buserlin (20 نانو جرام ) بعد المعالجة بجمع البروجسترون وeCG IU . ويتم جدولة المعالجة بالبروجسترون لكي تنتهي في يوم حقن النوق المانحة بالمنشط المنسلي gonadotropin ، وتضمن المعالجة بـ eCG وجود جريبات بالغة عند النوق المانحة بحوالي 24 إلى 48 ساعة . وعلى أية جال فإن جرعة eCG والاستجابة للإباضة عند النوق المستقبلة بواحد أو اثنين أو أكثر من ست أجسام صفراء وبالتالي فإن الاستجابة العالية من النوق المستقبلة إلى eCG غير مرغوبة لأنها قد تسبب ارتداداً مبكراً لأجسام الصفراءة .
ب- تحضير النوق المستقبلة بالبروجسترون :
يمكن الحصول على التزامن بين الجنين والرحم بعلاج البروجسترون بدون حث الإباضة حيث يعطى البروجسترون (100 مغ) يومياً اعتباراً من يومين بعد تلقيح النوق المانحة . وعلى أية حال وبسبب عدم وجود جسم أصفر فإن المعالجة بالبروجسترون يجب أن تستمر خلال الحمل .
ويمكن استخدام النوق المستأصلة المبيضين كمستلمة أيضاً ، حيث يتم معالجة النوق لمدة يومين مع استراديول Estradiol 17 (40 مغ/يوم) ثم الحقن اليومية من البروجسترون (100 مغ) . وقد أثمرت هذه المعالجة عن نسبة حمل قدرها 30% لكنها تركت بسبب الحاجة للمعالجة اليومية بالبروجسترون خلال الحمل .
(د) فحص النوق المستقبلة :
يجب فحص كل النوق المستقبلة في اليوم الذي يتم فيه النقل للتحقق من حدوث الإباضة ومن وجود جسم أصفر بالغ ، ويمكن القيام بهذا الفحص إما بتحديد مستوى بلازما البروجسترون أو بواسطة رؤية الأجسام الصفراء بالتصوير فوق الصوتي .
ويعتبر مستوى بلازما البروجسترون الذي يساوي 2 نانوجرام/مل أو يكون أعلى منها مؤشراً جيداً لوجود جسم أصفر ناضج ، وقد استعملت هذه التقنية بنجاح لفحص النوق المستقبلة بعد سبعة أيام من حث الإباضة . وعلى أية حال يمكن أن تعطي هذه التقنية نتائج ضعيفة إذا تم فحص النوق المستقبلة في اليوم الخامس والسادس بعد الإباضة لأن مستويات البروجسترون ليسة عالية بشكل كاف في بعض النوق في هذه المرحلة حتى وإن حدثت الإباضة .
ويبقى الكشف بالتصوير فوق الصوتي عن الجسم الأصفر هو التقنية الأكثر دقة وسرعة لكشف تلك الأجسام إذا تم القيام به من قبل شخص خبير وبالإضافة إلى ذلك فإن هذه التقنية تسمح بفحص النوق المستقبلة للكشف عن المشاكل المرضية مثل وجود سائل في التجويف الرحمي .
وفي النوق المستقبلة التي تم إعدادها بالإستروجين والبروجسترون يستند الاختيار على النسيج الصدوي Echotexture ونغمة الرحم ، فالنوق المستقبلة المثالية يجب أن يكون لديها تجانس رحمي مع غياب السائل أو الخزب ويكون الرحم مرتخياً .
1-نقل الأجنة :
يمكن القيام بنقل الجنين إلى النوق المستقبلة باستخدام التقنية الجراحية أو غير الجراحية .
أ- النقل الجراحي للجنين :
يتم القيام بالنقل الجراحي للجنين في جمل السنام الواحد والجمال ذات السنامين عن طريق شق الجناح الأيسر للبطن ، حيث يتم نقل الجنين إلى التجويف الرحمي من خلال ثقب يجعل في القرن الذي يتم إخراجه باستخدام ماصة Pasteur . ومن المفيد في جمل السنام الواحد أن يجعل حز صغير في الغشاء المصلي ( Serosa) أولاً قبل شق الطبقة العضلية الرحمية وإيداع الجنين . وعلى أية حال فإن هذه التقنية لا يمكن أن تستعمل في الحيوانات الصغيرة أو البكر لأن القرن الرحمي يكون قصيراً ومن الصعب جداً أن يتم استخراجه .
ب- النقل غير الجراحي للجنين :
تشتمل التقنية غير الجراحية لنقل الجنين على وضع الجنين بشكل مباشر في تجويف الرحم من خلال العنق باستخدام بندقية تلقيح الأبقار العادية ، حيث يحمل الجنين في قصبة بلاستيكية معقمة (0.25 ما أو 0.5 مل) ويوضع في بندقية النقل . وتغطى بندقية التلقيح أولاً بغطاء معقم مع فتحه جانبية ثم في غطاء صحي بلاستيكي ثان .
ويتم إعداد النوق المستقبلة بنفس الأسلوب المذكور في جمع الجنين ، وقد اقترح بعض الباحثين استعمال تخدير موضعي . يتم إدخال بندقية التلقيح في المهبل وتوجيهها نحو العنق ، ثم يثقب الغطاء بعد اجتياز الحلقة العنقية الأولى ثم تدخل البندقية أكثر في أحد القرنين الرحميين ، ويجب أن يتم المرور العنقي والإيداع الرحمي للجنين بشكل سريع لتجنب الحساسية المفرطة للعنق والغشاء المخاطي للرحم والتي قد تسبب إطلاق Prostaglandi F2a وفناء الجسم الأصفر .
وكبديل لذلك يمكن توجيه إدخال ماصة النقل بشكل مهبلي باليد مع لبس قفاز معقم ، وهذه التقنية مفضلة من قبل المبتدئين لأن المعالجة العنقية في المستقيم صعبة .
2- الإدارة بعد النقل :
اقترح بعض الباحثين معالجة النوق المستقبلة بعقاقير غير استراديولية ومضادة للالتهاب (Meglumine 500, IV mg flunixin ) لمنع تحرير Prostaglandi من الرحم كنتيجة للمعالجة العنقية وبالإضافة لذلك تعطى النوق المستقبلة مضادات حيوية لتجنب التلوث الرحمي . وبالنسبة للإناث المستقبلة التي تم إعدادها بالبروجسترون فإن إعطاء البروجسترون (100 مغ/يوم IM ) يجب أن يستمر حتى نهاية الحمل . وقد أدت المحاولات لاستبدال المعالجة بالبروجسترون بزراعة صناعية Silastic إلى الإجهاض . ويمكن تشخيص الحمل في النوق المستقبلة مبكراً بمقدار ثمانية أيام بعد النقل ، على أية حال فمن أجل زيادة دقة التشخيص يجب أن يؤخر حتى مضي أسبوعين بعد النقل . ويعتبر التثبت من وجود جسم طبيعي أصفر للحمل مهماً جداً من أجل قرار التوقف أو الاستمرار في المعالجة بالبروجسترون ، وإن لم يكن هناك جسم أصفر فإن بقاء الحمل سيتطلب حقنة يومية من البروجسترون (100 مغ) حتى الولادة . ويجب فحص النوق المستقبلة التي حافظت على الحمل البروجسترون الخارجي بشكل دوري لمعرفة أي شذوذ في الحمل مثل تقيح الرحم وتعطنه . وقد وجد عدد لا بأس به من النوق المستقبلة التي بقيت حامل بالبروجسترون الخارجي تعاني من عسر الولادة بسبب الارتخاء غير الكافي للعنق .
(ه) نتائج الحمل بنقل الجنين في الجمال :
بناء على الدراسة فإن نسب الحمل التي تم الحصول عليها بنقل الجنين في جمل السنام الواحد تتغير من 8 إلى 50% ، وتتأثر نسب الحمل بشكل واضح بالفصل ونوعية النوق المستقبلة . على أية حال فإن العوامل الأخرى مثل جانب النقل وطريقة النقل وعمر الجنين ليس لها أي تأثير على نسبة الحمل .
1- تأثير نوعية الجنين :
يمكن أن تتأثر نسبة الحمل والولادة بعد نقل الجنين بعدة عوامل ، وما تزال البيانات المتوفرة عن نقل الجنين في الجمال محدودة جداً وبالتالي فإن تأثير العوامل المختلفة على نسبة النجاح لم يتم التحقق منه بشكل كامل ، وأغلب ما يعرف اليوم عن هذا الموضوع من نقل الجنين يتعلق بجمل السنام الواحد .
ومن الصعب معرفة العلاقة بين نوعية الجنين ونسبة الحمل بسبب الصعوبة في تقييم الجنين المخصب ، ففي دراسة صنف فيها الجنين من 1 إلى 5 كانت نسبة الحمل أعلى لدرجة الجنين 1 من درجة 2 أو أكثر . ويوحي التحليل بأثر رجعي على الخصائص التركيبية لكل جنين منقول ونتيجة الحمل أنه يمكن تصنيف الأجنة في ثلاثة أصناف رئيسية فقط هي : نوعية جنين جيدة قابلة للنقل ، ونوعية جنين متوسطة قابلة للنقل ، وجنين غير قابل للنقل . ويتضمن الصنف الأول كل الأجنة المخصبة بالتطور الطبيعي طبقاً لتاريخ الجمع ، ويمكن أن تكون هذه الأجنة مستديرة أو منهارة ولكن يجب أن يكون لديها تألق جيد ولا تظهر العديد من الخلايا المقذوفة . وتحتوي أجنة النوعية المتوسطة على بضعة أنواع من الأمور الشاذة بما في ذلك خسارة التألق ( لتصبح مظلمة ) والتعرف الخارجي الضعيف . ويتضمن الجنين غير القابل للنقل كل الأجنة التي لديها نقص أساسي من المادة الخلوية أو في مرحلة متقدمة جداً من التحلل كما هو واضح في تشكلها العام أو لونها .
2- تأثير نوعية الأنثى المستقبلة :
تعتبر خصوبة النوق المستقبلة العامل الأكثر أهمية في نجاح نقل الجنين في أي فصيلة ، وقد لوحظ تقدم كبير في الحمل ونسبة الولادة بعد تبني برنامج صارم لاختيار النوق المستقبلة مستند على الزرع الرحمي وفحص العينة . وبشكل مشابه ذكر باحثون آخرون أن خصوبة الأنثى المستلمة وعمرها والتكافؤ لها تأثير هام على نسبة الحمل بعد نقل الجنين في جمل السنام الواحد ، فقد كانت نسبة الحمل في النوق المستقبلة بعمر 11 سنة أو أصغر حمل أعلى بمقدار 10% من النوق المستقبلة بعمر أكثر من 11 سنة . وبالإضافة لذلك كانت نسبة الحمل في النوق المستقبلة البكر تعادل ضعف النسبة في النوق المستقبلة متعددة الولادة . ويرجع تأثير العمر والتكافؤ بشكل مؤكد إلى مشاكل التكاثر المتزايدة مع تقدم العمر وعدد الولادات ، كما تتأثر نسبة الحمل أيضاً بعدد الأجسام الصفراء في النوق المستقبلة حيث أن النوق المستقبلة التي لديها إلى ست أجسام صفراء عندها فرصة أفضل للحفاظ على الحمل ممن لديها واحدة أو اثنتين أو أكثر من ست أجسام صفراء .
3- تأثير التزامن :
وتكون نسب الحمل أعلى إذا تم نقل الأجنة في النوق المستقبلة التي باضت بعد يوم أو يومين من النوق المانحة التي باضت في نفس اليوم أو اليوم السابق . وفي إحدى الدراسات تم الحصول على نسب الحمل الأعلى عندما نقل الجنين إلى رحم مستلمة باضت بعد 1.5 يوم من النوق المانحة ، كما أن نقل الجنين إلى النوق المستقبلة من التي قد باضت قبل يوم واحد من النوق المانحة لم يسفر عن حمل أو كان الحمل منخفضاً جداً (10%) . ويسمح الفحص المتسلسل للإناث المستلمة كل ثلاثة أيام بعد النقل بأن نظهر أن السبب الرئيسي لهذه النسبة المنخفضة للحمل في النوق المستقبلة التي باضت بعد النوق المانحة كان الفناء المبكر للأجسام الصفراء ، ويرجع السبب في Luteolysis إلى طبيعة المرحلة اللوتنية وربما بسبب إطلاق Prostaglandi F2a الذي نتج عن معالجة العنق و/أو حساسية الغشاء المخاطي للرحم . وبالإضافة إلى ذلك فإن نسب الحمل في النوق المستقبلة ذات إباضة يوم إلى يومين قبل النوق المانحة والمستمرة في استلام حقن يومية من البروجسترون كانت مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها من النوق المانحة . وعلى أية حال فإن المعالجة بالبروجسترون يجب أن تستمر خلال الحمل الذي تصاحبه العديد من الأضرار ، وبالإضافة إلى حقيقة أن المعالجة اليومية بالبروجسترون تعتبر مستهلكة للوقت إلا أنها تحتوي على بعض المخاطر الصحية مثل تطور تقيح الرحم والمضاعفات في الولادة والتحضير الناقص للضرع. وعلى الرغم من أن بعض الباحثين قد ذكروا أن إناث جمل السنام الواحد يمكن أن يعطين ولادة آنياً حتى عندما تعطى بروجسترون ، إلا أننا لاحظنا وجود مشاكل عديدة بما في ذلك التمدد غير الكامل للعنق والفصل المشيمي غير الناضج والإنتاج غير الكافي للحليب في النوق المستقبلة التي تتلقى البروجسترون .
ومن أجل تجنب خسارة الحمل بسبب luteolysis فإننا نبقي النوق المستقبلة تحت معالجة البروجسترون الخارجي حتى يوم تشخيص الحمل ، وعند ذلك التشخيص يتم تقييم وجود وحجم الأجسام الصفراء. فإن كان الجسم بعد 15 يوماً من النقل بقطر 20 ملم أو أكثر يتم توقيف علاج البروجسترون ، أما إذا لم يكن هناك جسم أصفر أو أظهرت إشارات ارتداد فيتم إبقاء الحمل بالبروجسترون الخارجي وتعطى النوق المستقبلة جرعة eCG (1500 إلى 2000 IU ) من أجل زيادة تطور الموجة الجريبية الجديدة . ويتم إعادة فحص كل النوق المستقبلة التي تعطى eCG بعد أسبوع ، ويتم إعطاؤها hCG (3000 IU) إن وجدت جريبات بقطر أكثر من 12 ملم . وتسمح هذه التقنية بصنع أجسام صفراء جديدة للحمل في العديد من النوق المستقبلة التي كانت ستفقد ملها بسبب فناء الجسم الأصفر الأولي، كما أن هذه الطريقة تمنع الحاجة إلى الاحتفاظ بالحمل في النوق المستقبلة التي لا يوجد لديها أجسام صفراء بواسطة المعالجة اليومية بالبروجسترون الذي يتطلب عملاً مركزاً ويعتبر غالياً جداً.
4- تأثير طريقة النقل :
من المتوقع عادة أن تكون نسب الحمل بعد النقل الجراحي أعلى من النقل العنقي ، وهذا لا ينطبق بالضرورة على جمل السنام الواحد حيث تحققت نسب الحمل المقارنة (30 إلى 40%) بكلا الطريقتين .
5- تأثير جانب النقل :
اقترح العديد من الباحثين أن نقل الجنين إلى القرن الأيسر سيكون أكثر فائدة من النقل إلى القرن الأيمن ، ويستند ذلك على حقيقة أن كل حالات الحمل تقريباً تحدث في القرن الأيسر في الجمال بالإضافة إلى أن هناك فرق في إطلاق PGF2a ألفا بين القرنين الأيسر والأيمن . ويعتبر نشاط Luteolytic الخاص بالقرن الأيمن موضعياً أما ذلك الخاص بالقرن الأيسر فهو شامل ومحلي أيضاً ولذلك فإن وضع الجنين في القرن الأيسر سيمنع إطلاق Prostaglandi F2a ألفا في مجرى الدم ويمنع Luteolysis وإن كان الجسم الأصفر في المبيض الأيمن . ومن أجل تجنب التأثير Luteolytic من القرن الأيسر فإن بعض الباحثين يفضلون استعمال النوق المستقبلة ذات الإباضة من الجانب الأيسر وفي جمل السنام الواحد لم يوضح عملنا وعمل الآخرين تأثيراً هاماً عن جانب النقل فيما يتعلق بجانب الإباضة . وتتشابه نسبة الحمل ووجود Luteolysis بعد النقل في النوق المستقبلة في القرن الأيسر أو القرن الأيمن سواء كانت الجسم الأصفر على الجانب الأيمن أو اليسر .
6- تأثير معالجة الجنين :
لا توجد دراسات متوفرة عن الشروط المثلى ( الوسط ودرجات الحرارة ) لتخزين أجنة الجمال ، ويستعمل أكثر الباحثين العاملين في هذا الحقل التوجيهات التي اقترحت لأجنة الأبقار والخيول . ويتم تخزين الأجنة لأقل من ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة في صحون بتري الصغيرة التي تحتوي على وسط حفظ غني مختلف عن وسط المجموعة وبالإضافة إلى ذلك فإننا نغطي تلك الصحون لمنع تعرض الجنين المباشر للضوء ، وهناك بالتأكيد حاجة للبحث فيما يتعلق بشرط المعالجة القصوى لأجنة الجمال الطازجة .
7- تأثير الفني :
فشلت الدراسات في معرفة أي تأثير هام لخبرة الفني على نسب الحمل بعد النقل العنقي و تتراوح نسبة الحمل من 22% إلى 68% طبقاً لخبرة التقني ، ولعل ذلك يرجع إلى استعمال الطريقة المستقيمية المهبلية لتجاوز العنق والتي تعتبر أكثر صعوبة في تعلمها من الطريقة المهبلية المباشرة التي ليست ممكنة دائماً خاصة في النوق الصغيرة أو التي لم تحمل أو إذا كانت يد الفني ضخمة جداً على اختراق المهبل .
8- تأثير الفصل :
على الرغم من أن النوق قادرة على النشاط المبيضي طوال العام خاصة إذا كانت جيدة التغذية ، إلا أن نسب الحمل تكون صفراً إذا تم نقل الجنين خلال أشهر السنة الحارة . وقد لوحظ حدوث ذلك مع انخفاض نسبة الحمل وزيادة الموت الجنيني المبكر في كل من النوق التي تنقل إليها الأجنة وتلك التي تلقح من شهر مايو إلى سبتمبر . ويجب تجنب مثل هذه التواريخ في التكاثر ليس فقط بسبب الخصوبة الضعيفة ولكن أيضاً بسبب النمو الضعيف للمولود الحوار خلال هذه الشهور .
رابعاً : تجميد الأجنة
يمكن الحصول على الإمكانية الكاملة لنقل الجنين فقط إذا تم تطوير تقنيات أخرى مثل الحفظ بعيد المدى للجنين ( التجميد ) وتحديد جنس وإنتاج الجنين خارج الجسم الحي .
ويقدم حفظ الجنين بالتجميد العديد من الفوائد الواضحة مثل الخزن طويل الأمد للمادة الوراثية من الأنثى وسهولة النقل والتبادل الدولي وتحسين إدارة النوق المستقبلة .
(أ) إضافة الغليسيرول :
يتم اختيار الأجنة ذات النوعية الجيدة للتجميد ، ويتم غسلها في وسط الحفظ الطازج بدون غليسرول ثم تنقل بشكل متعاقب في أربعة أوساط مختلفة بتركيز متزايد من الغليسيرول (0.5 مليمتر 0.75 مليمتر ، 1.0 مليمتر ، و1.5 مليمتر ) . ويوضع الجنين في كل محلول لمدة 10 دقائق قبل نقله إلى المحلول التالي ذي التركيز الأعلى من الغليسيرول ، وعندما تكتمل كل هذه الخطوات يوضع الجنين في قصبة 0.25 مل ويترك للتوازن لمدة 10 دقائق أخرى قبل التجميد .
(ب) منحنى التجميد :
يتم استخدام مجمد أجنة مبرمج للتجميد المثالي لأجنة الخيول والأبقار ، وتتم مراقبة درجة الحرارة في القصبة بشكل مستمر لمتابعة منحنى تجميد مثالي . ويتم تبريد الجنين من درجة حرارة الغرفة إلى درجة حرارة الـ Seeding (-7 درجة مئوية ) بمعدل 0.3 إلى 1 مئوية/دقيقة . وتحفظ القصبات في درجة –7 مئوية لمدة عشر دقائق ويتم إدخال بلورات الماء (Seeding) بلمس القصبات بعصا باردة جداً ، ويلي تلك المرحلة تبريد أكثر للقصبة من درجة –7 مئوية إلى درجة –30 مئوية بمعدل –0.3 درجة مئوية /دقيقة ، وتحفظ القصبات في درجة –30 مئوية لمدة عشر دقائق ثم تغمس بشكل مباشر في النتروجين السائل.
(ج) التذويب وإزالة الغليسيرول :
يذوب الجنين بوضع القصبات في حمام ماء بدرجة 37 مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ويتم تفريغ محتوى القصبة في صحن صغير ويزال الغليسيرول بالمرور المتعاقب في وسط يحتوي على سكروز و/أو تركيز متناقص من الغليسيرول . ثم يوضع الجنين في قصبة جديدة وينقل إلى النوق المستقبلة بنفس الأسلوب الموصوف للجنين الطازج .
(د) النتائج والتطورات المستقبلية :
أثمرت التجارب الأولية للجنين المجمد لجمل السنام الواحد نتائج حمل ضعيفة جداً (10%) ، وعلى أية حال فإن البحث ما يزال مستمراً لتحديد الظروف الأفضل ( مرحلة الجنين ، الوسط ، طبيعة وتركيز المادة الحافظة (Cryoprotectant ) ، ومنحنى التجميد ) لتجميد الجنين في هذه الفصيلة . وتعتبر العقبة الرئيسية لتجميد الجنين في جمل السنام الواحد هي الحجم الكبير بشكل نسبي للجنين المجموع من الرحم ، وقد ميز حجم الجنين كعامل رئيسي في نجاح تجميد الجنين الذي يكون حجمه أكبر من 250 عملية التجميد . ولسوء الحظ فإن جمع الجنين قبل التفقيس ليس سهلاً في جمل السنام الواحد .
خامساً : التكاثر الاصطناعي ومعالجة الجنين
يعتبر التخصيب المساعد حقلاً جديداً بشكل نسبي في الطب البيطري الذي يكسب الكثير من الاهتمام كأداة بحث وكطريقة إعادة إنتاج بديلة للأنسال أو الفصيلة المعرضة للخطر، وأيضاً لمعالجة بعض حالات عدم الخصوبة في الحيوانات الثمينة . وتتضمن تقنيات إعادة الإنتاج المساعدة التخصيب خارج الجسم الحي (IVF) ونقل الأمشاج داخل قناة فالوب (GIFT) ، وبعض المعالجات للجنين أو الأمشاج مما يسمح بزيادة عدد النسل خارج الجسم الحي ( الشطر والاستنساخ ) ونقدم هنا مناقشة للفوائد وعملية هذه التقنيات في الجمال على الرغم من أن الأبحاث التي نشرت في هذه الفصيلة محدودة .
(أ) التخصيب خارج الجسم :
لا يزال التخصيب خارج الجسم الحي في المرحلة التجريبية في الجمال ، فقد تم إنتاج الجنين خارج الجسم الحي في حيوانات اللاما . وعلى أية حال لا توجد أي تقارير حتى الآن عن نسل حي من جنين أنتج خارج الجسم الحي . ومن الواضح أن هناك نقص في البيانات العلمية التي استعملت لتحضير المني وخلية البيضة مأخوذة من الأعمال التي تمت في فصيلة الأبقار . وتعتبر نسب نجاح التخصيب خارج الجسم الحي منخفضة جداً ولم يتم الحصول على جنين حتى الآن بالمني المقذوف ، وعلى أية حال وبسبب فوائده المتعددة فمن المتوقع أن يتطور هذا المجال بشكل سريع جداً ويصل إلى الإمكانية التجارية.
ويقدم التخصيب خارج الجسم الحي بضعة فوائد علمية وتكاثرية وطبية يمكن تلخيصها كالتالي :
- يمكن معالجة عدم الخصوبة في الحيوانات الثمينة ، ففي النوق يمكن استخدام التخصيب خارج الجسم الحي لإنتاج جنين من حيوانات تعاني من انسداد قنوات الإباضة وتعاني أمراضاً رحمية أو عنقية حادة . وكذلك بالنسبة لذكور بنوعية مني منخفضة جداً فيمكن أن يعاد الإنتاج باستعمال تقنيات مثل حقن المني ( microinjection) .
- يسمح للعلماء أن يكون عندهم القدرة على الوصول إلى مراحل تطور الجنين والتي تكون صعبة جداً في الحيوان الحي ، وبذلك تصبح مثل هذه التقنيات التي تتطلب جنيناً صغيراً في مرحلة التعلق بقناة الرحم من أجل تجميده أو شطره أو استنساخه أمراً محتملاً .
- يلبي الحاجة الضرورية للطرق المعتمدة لتقييم القدرة التخصيبية للمني .
- يعرض نموذجاً لدراسة التخصيب والتطور الجنيني .
- يسمح باستعمال مادة وراثية من النوق التي ماتت إذا تم إدخال برنامج لحفظ خلية البيضة ، حيث جمع خلية البيضة من الحيوانات التي ماتت مؤخراً أو عندها أمراض طرفية وتخزينها في حالة تجميد حتى الاستعمال . ويعتبر ذلك مهماً خاصة لحفظ مادة وراثية من حديقة الحيوانات أو الحيوانات البرية .
- يسمح باستعمال المني المحدد الجنس لإنتاج جنين بجنس معين .
ويعتمد نجاح التخصيب خارج الجسم الحي على بضعة عوامل مثل الأصل وتحضير خلية البيضة والمني وظروف التخصيب وتطور الجنين . ومن أجل أن تتمكن خلية البيضة والمني من استكمال التخصيب فيجب أن تخضع إلى التغييرات الكيمياوية الحيوية والتشكيلية التي تسمى النضوج لخلية البيضة ، والقدرة (Capacitation) وتفاعل الأكروزوم ( acrosome ) للنطف .
1- جمع خلية البيضة والنضوج :
هناك مجموعتان من الطرق المتوفرة لجمع خلية البيضة والتي يمكن تطبيقها على الجمال : الأولى جمع خلية البيضة في الجسم الحي والثانية جمع خلية البيضة بعد استئصال المبيض . وتعتبر الطريقة الأولى الأكثر رغبة إن كانت الأنثى ستستعمل بشكل مستمر في هذا البرنامج . وعلى أية حال فإن جمع البيضة بعد استئصال المبيض أو التشريح بعد الوفاة قد تكون التقنية الأكثر كفاءة للعمل التجريبي .
أ- جمع خلية البيضة في الجسم الحي :
يمكن أن يتم جمع خلية البيضة من الحيوان بشكل جراحي أو عن طريق توجيه الجريب بالموجات فوق الصوتية ، وقد تم تجربة الجمع الجراحي لجريب كامل في إناث متعددة الإباضة بـ eCG أو FSH . ويتم الوصول إلى المبيض عن طريق شق البطن وتزال كل الجريبات البالغة (10 إلى 15 مليمتر ) من سطح المبيض وتشرح في المختبر . وتعمل هذه التقنية جيداً بشكل نسبي إذا لم يتم حث الحيوانات أكثر من اللازم (overstimulated) ولكنها ليست عملية للإنتاج المتكرر لخلية البيضة من نفس الأنثى . ثم تزال خلية البيضة من الجريب بالتشريح تحت المجهر ، وتكون تلك الخلية عادة في مرحلة متقدمة من النضوج ، خاصة إذا تمت العملية من 12 إلى 24 ساعة بعد حث الإباضة مع eCG . وعلى أية حال فإن نسبة الإنتاج يمكن أن تكون منخفضة جداً بعد هذه المعالجة لأن الجريبات تصبح لينة جداً وتنزف بشكل سهل .
وأفضل أسلوب في تقنيات جمع خلية البيضة في الجسم الحي هو توجيه الجريب بالموجات فوق الصوتية ( Transvaginal ultrasound ) حيث يتم تخدير الأنثى وإعدادها مثل طريقة جمع الجنين مع تخدير موضعي منخفض . ويتم إدخال مسبر مهبلي ( curvilinear أو مسبر القطاع ، 5 أو 7.5 ميغاهرتز ) مربوط إلى مقبض طويل ( 30 إلى 40 سنتيمتراً ) في المهبل ، ويتم معالجة المبيض بشكل مستقيمي ويوجه نحو المسبر . وعند تمييز الجريبات وتثبيتها يتم إدخال إبرة طويلة خلال المسبر تتقدم ببطء خلال الحائط المهبلي ويتم سحب المحتوى الجريبي باستعمال مضخة شفط . وتتطلب هذه التقنية معالجة قليلة وتعطي نسبة الإنتاج من 40 إلى 50% .
ب- جمع خلية البيضة بعد استئصال المبيض أو التشريح بعد الوفاة :
تستخدم أغلب الأبحاث حول IVF خلية البيضة المأخوذة بشكل مباشر من المبيض بعد الذبح أو بعد استئصال المبيض ، حيث يغسل المبيض بالملح ويوضع في ترمس في درجة 38 مئوية وينقل خلال 30 دقيقة إلى المختبر حيث يشطف ويوضع في مضادات حيوية وملح. وتجمع عقد خلية البيضة (COC) بعد ثرم المبيض بنصل آلة حلاقة وملاحظته تحت مجهر تشريح ، وتغسل في محلول معدل (Tyrode hepes talp ) يحتوي على :
114 ملم Nacl : و3.1 ملم KCl ، و2.0 NaHCO و0.3 مليمتر NaH2PO4 و10 مل صوديوم ، و2 Ca Cl lactate MgCl 0.5 ، مليمتر 2 Hepes 10 ، مليمتر ) أكمل بمل 3 BSA mg3 / كسر M25 , V صوديوم Pyruvate ومل gentamycine 50/g كبريتات.
وأثمرت هذه التقنية عن معدل 6.4 خلية بيضة في اللاما .
ج- تقييم خلية البيضة :
يتم فحص COC لتحديد مرحلة النضوج خاصة توسع خلايا الركام ، ويكون لدى خلية البيضة التي جمعت قبل الإباضة مباشرة طبقة خلية ركام متوسعة . وتكون تلك التي تم الحصول عليها بشق المبيض من مجموعة متباينة من الجريبات وعادة في مراحل مختلفة من النضوج . ويعتبر اختيار خلية البيضة قبل الاحتضان مهماً جداً لأنه وجد في اللاما أن 17 إلى 52% من خلية البيضة تتحلل بعد الإنتاج من الجريب .
د- النضوج خارج الجسم الحي :
تبقى خلية البيضة في معظم الثدييات في مرحلة تضاعف الصبغيات من الدور الانتصافي الأول ( Meiotic prophase ) خلال تطور الجريب ، وعند اقتراب الإباضة تخرج خلية البيضة من مرحلة خمول هذه لتستمر في الانقسام ، وهذا التفاعل في طور الانقسام يسمى نضوج خلية البيضة .
وعادة يستخدم معياران لوصف مرحلة نضوج خلية البيضة : السيتوبلازميك ( Cytoplasmic) ونضوج النواة ، ويتمثل الأول في هجرة الحبيبات اللحائية نحو غشاء البيضة ( Oolema ) واكتساب الزغيبات ( microvilli) على سطح الخلايا . أما نضوج النواة فيتمثل بظهور حويصلة ودليل النشاط الانقسامي ( metaphase وanaphase1 وmetaphase2 ).
وقد تم تحقيق النضوج خارج الجسم الحي في اللاما بالاحتضان في درجة 38.5 مئوية تحت 5% من ثاني أوكسيد الكربون في هواء عالي الرطوبة في خلية مزروعة بوسط TCM 199 مكملة ب 0.5 نانوجرام /مل oFSH ، و5 نانوجرام /مل oLH ،و1 نانوجرام /مكل estradiol 17 ، و25 نانومتر Pyruvate و10% مصل متبرع عجل مخصي . وتحت هذه الظروف من الاحتضان فإن 62% من خلية البيضة تكون في المرحلة الثانية ( Metaphase II) بعد 36 ساعة من الزرع .
2- تحضير المني :
في نهاية عملية تكون الخلايا المنوية لا تكون النطف قادرة على التخصيب ، ويتم اكتساب هذه الخاصية في البربخ ، وتتم هذه العملية التي تسمى النضوج البربخي خلال عبور البربخ وتكتمل عندما تصل النطف إلى ذيل البربخ .
وإحدى الخصائص الرئيسية للنطف البالغة هي اكتساب الحركة والتي تنتج عن التغييرات الكيمياوية الحيوية في غشاء البلازما ، وتتعلق هذه التعديلات بشكل رئيسي بالبروتين السكري والمادة الشحمية للغشاء وخاصة كوليسترول التكامل . وحتى بعد هذا النضوج فإن النطف لا تصبح قادرة على التخصيب حتى تتعرض للمنطقة التناسلية في الأنثى لبعض الوقت ، وبعد الانتهاء من ذلك تسمح هذه العملية والتي تسمى القدرة Capacitation للتلقيح في أن تصبح قادرة على الارتباط بالمنطقة الشافة لخلية البيضة . والنتيجة الرئيسية لهذه العملية هي التعديل أو إزالة المواد التي تكثفت في غشاء بلازما النطف خلال العبور البربخي أو بعد الاتصال بالبلازما النووية . وتعمل هذه التعديلات على إعداد خلية الحيوان المنوي على المرور بتغييرات أخرى خاصة في مستوى الأكروموزوم ( acrosome reaction ) والتي تعد التغييرات النهائية المطلوبة لخلية الحيوان المنوي لكي يخترق غلاف خلية البيضة .
وتحدث مرحلة اكتساب القدرة في أغلب الفصائل في الجزء الأقصى لبرزخ الأنبوب الرحمي ، حيث أن الآليات التي تسيطر على تلك العملية في هذا المستوى غير مفهومة بالكامل . وقد تم التعرف على بعض المواد الموجودة في قناة البيض على أنها عوامل مساعدة لاكتساب القدرة وتتضمن :
Hypotaurine , taurine , glucosaminoglycans , fucosidase , arylsulfatase , neuraminidase , proteinase , glucuronidase , amylase acetylhexosaminidase .
ومن المعروف منذ 30 سنة أن التغييرات التي حصلت في القدرة يمكن الحصول عليها خارج الجسم الحي في الأوساط المعرفة بشكل كيميائي ، أما في الجمال فليس هناك دراسات على القدرة لرد فعل الأكروموزوم ( Capacitation و acrosome reaction ) في المني المقذوف . وفي الدراسات الوحيدة على IVF في اللاما استخدم المني من ذيل البربخ التي تعتبر أسهل في اكتساب القدرة من النطف المقذوفة . ويتم غسل الحيوان المنوي البربخي بالتمخض ( Centrifugation) في وسط TALP مكون من :
100 ملم NaCl ، و3.1 ملم KCl ، و25 ملم Na HCO3 ، و0.3 ملم NaH2PO4 ، و21.6 ملم صوديوم ، و2 ملم CaCl2 ، و0.4 ملم MgCl2 ، و10 ملم Hepes ، و1.0 ملم صوديوم ، و3 مغ/مل BSA ، و50 نانوجرام /مل كبريتات gentamicin .
ويتم تمخيض المني مرتين في 300 غ لمدة خمس دقائق ثم تفصل الحيوانات المنوية المتحركة وغير المتحركة على عمود Percoll متقطع الكثافة بالتمخيض في 1000 غ لمدة 30 دقيقة .
3- التخصيب خارج الجسم وتطور الجنين :
تم إجراء التخصيب خارج الجسم الحي بنجاح في اللاما حيث تم حضانة المني البربخي الممخض من قبل في وسط TALP بخلية بيضة متعرية أنضجت خارج الجسم الحي بوجود 5 نانوجرام/مل من Heparin في وسط تخصيب هادئ مكون من :
NaCl 114.0 مليمتر ، 3.2 مليمتر Nah- , KCL co25.0 مليمتر3 NaH 0.34 , PO 2 10 ، صوديوم مليمتر مليمتر 2.2.0 CaCl lactate MgCl 0.5 مليمتر 0.25.2 صوديوم مليمتر6 مل Pyruvate/mg حر حامضي سمين BSA ، ومل gentamicin 50/g كبريتات.
وتم الحصول على نسبة تخصيب قدرها 29% باستعمال هذه التقنية ولكن 6% و4.7% فقط من البيض المخصب وصل على التوالي إلى مرحلة الكيسة الرومية المبكرة والتفقيس بعد الزرع المشترك مع خلية متعلقة بقناة الرحم في اللاما ، وليس هناك شك أن التخصيب خارج الجسم يمكن أن ينجز في الجمال ، وعلى أية حال فمن المهم أن يطور هذا الإجراء بالمني المقذوف .
(ب) المعالجة وتقنيات التكاثر الاصطناعي الأخرى :
إن نقل الجنين والتخصيب خارج الجسم الحي يفتحان آفاقاً جديدة للتحسين الوراثي في الجمال ، ويمكن أن ترتفع قوة هذه التقنيات إذا تمت معالجة الجنين قبل النقل . وتهدف أغلب إجراءات معالجة الأمشاج أو معالجة الجنين إلى زيادة عدد الأجنة التي عندها شكل وراثي متماثل ( توائم ثنائية أو رباعية أو استنساخ ) ، أو تخصيب خلية بيضة بمني من الذكور غير الخصبة ( حقن المني بالمجهر ) ، أو إنتاج جنين جنس معين ( تحديد الجنس ) ، أو أكثر من ذلك الاستنساخ الحقيقي لحيوان متفوق .
1- نقل المشيج داخل قناة فالوب :
يتضمن نقل الأمشاج داخل قناة فالوب وضع خلية البيضة التي جمعت من النوق المانحة في قناة رحم مستلم مفقس أو ملقح ( قناة البيض ) ، وبالتالي فإن التخصيب وتطور الجنين المبكر يحدث في النوق المستقبلة . ويمكن نقل العديد من خلية البيضة بهذا الأسلوب ويتم تخصيبها ثم تؤخذ في مرحلة الكيسة الأرومية بشطف الرحم بعد 6.5 إلى 7 أيام .
2- شطر الجنين :
يتضمن شطر الجنين قص الجنين إلى نصفين أو أربعة أرباع لإنتاج أجنة جديدة عندها نفس الصفات الوراثية تماماً ، حيث يتم شطر الجنين باستعمال شفرة مجهرية (Microblade ) ويثبت الجنين في أحد الأطراف بالامتصاص بينما يقطع النصل في المنتصف. ويجب أن تتم هذه التقنية مع التوتية (البيضة الملقحة قبل انشقاقها ) أو الكيسة الأرومية المبكرة التي يصعب الحصول عليها في الجمال إلا إذا تم شطف الأجنة من قناة المبيض .
3- نسخ الجنين :
بشكل نظري فإن كل قطعة أرومية ( blastomere ) من الجنين قادرة على إعطاء جنين كامل جديد إذا توفرت شروط التطور الصحيحة ، وبالتالي يمكن إعادة إنتاج الجنين بشكل غير محدد مع كل قطعة جديدة . وتم تطبيق هذه التقنية على الماشية وجنين الأغنام وتم الحصول على بضعة أنسال .
وعلى أية حال فقد ذكرت العديد من المشاكل مع الحمل باستعمال هذا الجنين مثل عجول كبيرة بشكل غير طبيعي أو تمشيم شاذ .
4- جنس الجنين :
يعتبر اختيار جنس الجنين قبل النقل مثار اهتمام العديد من أنظمة الإنتاج ، خصوصاً في حالة جمل السباق للسنام الواحد ، ويمكن تصنيف التقنيات المتوفرة التي تسمح باختيار جنس الجنين في مجموعتين :
1 ) تلك المستندة على فصل النطف الحاملة لـ X و Y ( مني الجنس ) واستعمال المجموعة المنتقاة لتعديل نسبة الجنس .
2) تلك المستندة على تحديد جنس الجنين بعد الجمع ، ونقل تلك التي لديها الجنس المطلوب فقط .
أ- فصل خل
